|
2023年11月，北京大学肿瘤医院、北京大学深圳科研生院及西南医科大学基本医学院，合作在Wiley出版社（医学-病毒学国际一流刊物）《医学病毒学杂志》JOURNAL OF MEDICAL VIROLOGY（JCR Q1）正式发布了题为：“Molecular PET/CT mapping of rhACE2 distribution and quantification in organs to aid in SARS‐CoV‐2 targeted therapy”的科研论文。
团队依托安身于SARS-CoV-2的需要，研发了基于血管紧张素转化酶2（ACE2）的核素探针，并在rhACE2组织/器官原位模型中进行的分子影像可视化评定科研。
科研背景：
血管紧张素转换酶2 (ACE2)是SARS‐CoV‐2感染人体的关键受体，其在肾素‐血管紧张素系统中起关键负调控功效，并在正常生理要求下促进肾脏和肠道中的氨基酸运输。科研发掘，ACE2可能作为较好的治疗靶点，由于无论SARS-CoV-2怎样进化，都依赖于ACE2进入人体细胞。
重组人ACE2 (rhACE2)做为该蛋白的可溶性形式，做为诱饵，能够阻断病毒与机体膜结合形式的ACE2结合。日前多项临床前及临床实验科研显示，rhACE2能够有效中和病毒、预防感染及缓解病情。另外，rhACE2做为外源性弥补物，可缓解因病毒感染后ACE2下降而引起的RAS系统失衡。然而，因为ACE2在RAS系统中的负调控功效，针对某些有合并症的病人运用rhACE2时应更加小心。本科研首次成功构建了rhACE2-组织/器官原位模型，创立了rhACE2给药剂量与分子影像的高度关联性。经过ACE2特异性核素探针68Ga-HZ20动态监测组织/器官原位的rhACE2，有助于评定rhACE2 在器官中的驻留能力、分析其对 SARS-CoV-2 的预防能力和对COVID-19 的治疗潜能，同期亦为rhACE2疗法精细方法的制定供给了新的见解和思路。
科研办法：
本科研在课题组前期工作基本上，经过调节标记温度，加强了探针的放射化学产率和比活度。采用放射性-有效液相色谱法（Radio-HPLC）对探针的标记率和稳定性进行检测。给小鼠注射高剂量的探针后采用HE染色评定探针的安全性，并运用免疫组织化学染色（IHC）检测小鼠重点脏器中ACE2的本底表达水平。在对探针进行综合表征后，构建rhACE2在小鼠皮下、肿瘤、肝脏、脾脏和脑的原位模型，并经过Micro-PET/ CT示踪rhACE2的分布， 经过SUV值、靶本比（rhACE2注射部位与肌肉）、靶部位的离体显像及% ID/g比较区别剂量组之间的探针摄取差异。最后，分析靶部位探针摄取与rhACE2给药剂量的关联性，并经过Western blot对模型进行验证。
科研结果：
1.68Ga‐HZ20探针的标记、体外特、安全性评估及ACE2在小鼠器官中的表达
68Ga‐HZ20放射性合成过程如图1A所示。在65°C、85°C和95°C要求下，68Ga‐HZ20探针的放射性标记率分别为74.03%、96.42%和78.60%(图1B)，放射化学产率分别为61.51±4.47%、78.99±3.92%和66.34±5.51% (图1C)。68Ga - HZ20在常温下180 min内，放射化学纯度均高于96% (图1D)。同期高剂量的探针并未对小鼠导致器质性损害(图1E)。在小鼠支气管上皮细胞、肾脏和小肠中均观察到ACE2高表达(++)(图1F)，该结果支持SARS-CoV-2的呼气道和粪-口传播，以及SARS-CoV-2在感染后导致肾损害和腹泻等。
图1. (A) 68Ga‐HZ20探针的合成示意图。(B) 68Ga‐HZ20在区别温度下的放射性标记率。(C) 68Ga‐HZ20在区别温度下的放射化学产率。(D) 68Ga‐HZ20在生理盐水和5% HSA中的稳定性。(E)小鼠重点器官HE染色。(F)小鼠重点器官中ACE2表达水平的IHC染色。
2．68Ga-HZ20在rhACE2皮下模型中的显像科研
向KM小鼠右肩分别注射区别剂量(0.1、0.2、0.4、0.8 nmol)的rhACE2蛋白。PET影像表示，68Ga‐HZ20在身体对rhACE2拥有很高的特异性和敏锐性(图2A)，该探针能够准确定位rhACE2聚集的区域，揭示rhACE2的分布。并且摄取随着rhACE2注射剂量的增多而增多。探针摄取在120 min达到峰值，而后缓慢下降(图2C)。随着rhACE2注射量的增多，探针的靶本比亦随之增多，在240 min时各剂量组分别达到2.50±0.41、8.24±0.47、15.57±0.49和25.45±1.48(图2D)。在体图像采集完成后，对rhACE2 (0.2 nmol, 0.4 nmol)注射部位和重点器官取样进行离体影像(图2E)，结果表示探针在rhACE2注射部位有显著的剂量依赖性摄取。分析注射后120 min SUVmax与rhACE2剂量的关联性，R2为0.9914(图2F)。对0.4 nmol组进行阻断科研，观察到阻断组在rhACE2注射部位的摄取显著减少(图2B)，且在所有时间点，两组之间均存在明显性差异(图2G)。Western blotting表示rhACE2蛋白被成功定位置于皮下注射部位，在身体保持稳定(图2H)。
图2. (A)皮下注射区别剂量rhACE2后的PET/CT影像。白色圆圈为rhACE2注射部位。(K, B表率肾和膀胱)。(B) 50 μg HZ20阻断后小鼠的PET影像。(C) rhACE2注射部位SUVmax的比较。(D) rhACE2注射部位与肌肉的SUVmax比值。(E)注射部位和重点器官的离体影像。(F) SUVmax与rhACE2剂量关联性分析。(G) 0.4 nmol阻断与非阻断组的SUVmax比较。(H)注射部位rhACE2蛋白的Western blot。
3．68Ga-HZ20在rhACE2肿瘤模型中的显像科研
在A549荷瘤小鼠瘤内注射区别剂量rhACE2后进行PET/CT影像，结果表示在A549肿瘤中未观察到探针的摄取；在rhACE2注射组肿瘤中的摄取随着剂量的增多而增多(图3A)，反应出68Ga‐HZ20能准确地示踪肿瘤中的rhACE2。在探针注射后30 min，肿瘤部位的SUVmax分别达到0.3±0.08、0.6±0.07、0.75±0.03和0.94±0.03(图3B)。对肿瘤与肌肉的SUVmax比值（靶本比）分析表示，在注射相同剂量的rhACE2蛋白时，该比值随时间而增多， 240 min时靶本比分别为0.88±0.54、4.59±0.32、6.22±1.56、7.13±0.54(图3C)。肿瘤组织的离体影像亦呈剂量依赖性(图3D)。γ‐计数分析表示，区别剂量组差异明显(图3E)。探针注射后30 min rhACE2与SUVmax的关联性最高，R2为0.9176(图3F)。Western blotting进一步验证了显像结果(图3G)。
图3. (A)瘤内注射区别剂量rhACE2后的PET/CT影像。带虚线的白色方框暗示肿瘤及rhACE2注射部位(K, B分别表率肾脏和膀胱)。(B)肿瘤中SUVmax的比较。(C)肿瘤与肌肉的SUVmax比值。(D)肿瘤组织离体PET影像。(E)肿瘤组织% ID/g的比较。(F)肿瘤 SUVmax与rhACE2剂量关联性分析。(G)肿瘤组织中rhACE2的Western blot。
4．68Ga‐HZ20在rhACE2肝脏原位模型中的显像科研
为了科研68Ga‐HZ20探针对器官中rhACE2的检出能力，在KM小鼠肝脏原位注射区别剂量的rhACE2后进行了PET影像科研。PET图像表示探针在肝脏中有显著的rhACE2剂量依赖性摄取(图4A)。与对照组相比，rhACE2注射组肝脏SUVmax值更高，注射15 min后的SUVmax值分别为0.43±0.02、0.52±0.02和0.76±0.01(图4B)。rhACE2注射组靶本比更高，在60 min时分别为1.3±0.20、2.54±0.27、3.95±0.52 (图4C)。肝脏中% ID/g亦呈rhACE2剂量依赖性(图4D)。探针注射后60 min rhACE2与SUVmax的关联性最高，R2为0.9994(图4E)。Western blotting结果表示rhACE2被成功注射到小鼠肝脏 (图4F)。
图4. (A)肝脏原位注射区别剂量rhACE2后的PET影像。白色圆圈暗示肝脏注射部位(L、H、B分别表率肝脏、心脏和膀胱)。(B)肝脏中SUVmax的比较。(C)肝脏与肌肉的SUVmax比值。(D) 区别剂量组肝脏% ID/g比较。(E) 肝脏SUVmax与rhACE2剂量的关联性分析。(F)肝脏中rhACE2的Western blot。
5．68Ga‐HZ20在rhACE2脾脏原位模型中的显像科研
将rhACE2原位注射到小鼠脾脏，PET影像表示0.4 nmol组探针显著聚集(图5A)。对照组与0.2 nmol rhACE2注射组脾脏摄取值差异较小，而0.4 nmol组显著高于其他两组，注射后15 min的SUVmax值分别为0.28±0.03、0.28±0.01和0.58±0.01(图5B)。一样，对照组和0.2 nmol组脾脏与肌肉的摄取比值显著小于0.4 nmol组，60 min分别为1.25±0.20、1.30±0.14和4.13±0.05(图5C)。离体显像结果表示出脾脏的显著摄取，尤其在rhACE2注射点更加浓聚(图5D)。rhACE2注射组的% ID/g明显高于对照组，分别为0.41±0.01、0.53±0.01和0.86±0.03(图5E)。探针注射后45 min时rhACE2与SUVmax的相关性最高，R2为0.9095(图5F)。一样，Western blot结果表示脾脏中几乎无ACE2的表达， rhACE2注射组中观察到rhACE2条带，但其含量显著小于相同剂量的其他模型组，分析其原由可能是因为脾脏体积小，术中rhACE2渗漏导致(图5G)。
图5. (A)脾脏原位注射区别剂量rhACE2的PET/CT影像。白色方框为脾脏 (K、B分别表率肾脏和膀胱)。(B)脾脏中SUVmax的比较。(C)脾脏与肌肉的SUVmax之比。(D)脾脏离体PET显像。(E)区别剂量组脾脏% ID/g比较。(F) 脾脏SUVmax与rhACE2剂量的关联性分析。(G)脾脏中rhACE2的Western blot。
6．68Ga‐HZ20在rhACE2-脑原位模型中的显像科研
Micro-PET影像表示，探针在对照组小鼠脑内有轻微摄取，在rhACE2注射组脑内更加显著(图6A)。SUVmax分析表示，探针注射后任一时间点，rhACE2注射组与对照组的摄取值均有统计学道理 (图6B)。脑与肌肉的靶本比亦表示出一致的结果，120 min时分别为2.23±0.10、2.85±0.06、3.34±0.12和4.23±0.12(图6C)。脑组织离体显像表示注射组脑中有显著的探针摄取，尤其是0.8 nmol组(图6D)。脑组织% ID/g亦表示rhACE2注射组明显高于对照组(图6E)。探针注射后30 min rhACE2与SUVmax的关联性最高，R2为0.9913(图6F)。Western blot表示脑组织本身有微量ACE2表达，注射组有显著聚集 (图6G)。
图6. (A)脑内原位注射区别剂量rhACE2的PET/CT影像。白色圆圈暗示脑注射部位(K, B分别表率肾脏和膀胱)。(B)脑内SUVmax的比较。(C)脑与肌肉SUVmax的比值。(D)脑组织离体PET显像。(E)脑组织% ID/g比较。(F) 脑SUVmax与rhACE2剂量的关联性分析。(G)脑中rhACE2的Western blot。
小结与展望：
1.本科研经过对标记要求的优化，制备了高放化产率的ACE2靶向核素探针68Ga‐HZ20。
2.经过运用68Ga-HZ20探针对小鼠“rhACE2-组织/器官”原位模型进行PET/CT显像，创立了探针摄取与rhACE2剂量高度关联性，有助于rhACE2疗法的进一步科研和应用。
3.首次成功构建了rhACE2-组织/器官原位模型，针对其他模型的构建及探针的快速评估供给了思路。
//通讯作者为西南医科大学刘友平教授、北京大学肿瘤医院朱华科研员、北京大学深圳科研生院刘琦科研员。
第1作者为北京大学肿瘤医院与西南医科大学联合培养的王紫蕾朋友、北京大学肿瘤医院赵传科副科研员、河北北方学院附庸第1医院李传贵专家医师。//
Author information
原文链接：http://doi.org/10.1002/jmv.29221
Citation:Wang, Z., Zhao, C., Li, C., Liu, S., Ding, J., He, C., Liu, J., Dong, B., Yang, Z., Liu, Q., Zhu, H., & Liu, Y. (2023). Molecular PET/CT mapping of rhACE2 distribution and quantification in organs to aid in SARS-CoV-2 targeted therapy. Journal of medical virology, 95(11), e29221. https://doi.org/10.1002/jmv.29221.
| 
发表于 2024-10-10 09:45:40