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背景介绍
糖代谢是细胞能量合成的重点方式，是维持机体生命活动的基本。在氧气充足的环境中，正常细胞经过葡萄糖氧化磷酸化(Oxidative phosphorylation，OXPHOS)途径产能，1mol葡萄糖彻底氧化可生成36mol ATP。在没氧环境下，葡萄糖经没氧糖酵解代谢转化为乳酸，1mol葡萄糖仅能产生2mol ATP。1927年Warburg首次发掘肝癌细胞相比其他细胞拥有更高的葡萄糖摄取率及加强的糖酵解反应为肿瘤细胞增殖供给重点能量的现象。随后科研发掘相较于OXPHOS，即使在氧气充足的状况下，肿瘤细胞广泛倾向于有氧糖酵解为其供能，并叫作这一转变为“Warburg效应”。
有氧糖酵解是在细胞质中进行的，在有氧状况下，1mol葡萄糖被糖酵解代谢为2mol丙酮酸，并得到2mol ATP，而后丙酮酸在乳酸脱氢酶的功效下被还原成乳酸，得到另一2mol ATP。虽然单分子葡萄糖的有氧糖酵解产能量低，但其反应过程少、产能速度高，总产能量大，更加能够满足肿瘤细胞快速增殖的能量需求中。这一现象日前已认为不仅是肿瘤细胞的标志特征之一，增殖细胞及其他体外转化细胞亦能够经过有氧糖酵解调节其能量和底物需求以应对持续变化的环境前提[1]。
控制糖酵解过程在治疗前列腺癌科研中的应用
2024年2月8日，武汉市中心医院泌尿外科昌磊副专家医师科研团队在Cell Communication and Signaling杂志上发布了题为“1-Pyrroline-5-carboxylate inhibit T cell glycolysis in prostate cancer microenvironment by SHP1/PKM2/LDHB axis”的科研论文。她们的科研显示，P5C经过靶向SHP1/PKM2/LDHB复合体来控制T细胞的糖酵解过程。科研结果为制备抗P5C抗体供给了机制基本，该抗体可用于恢复T细胞糖酵解和控制前列腺癌的生长。
 图 SHP1、PKM2和LDHB相互结合，P5C控制T细胞糖酵解[2]
注：糖酵解关联生化检测指标：丙酮酸激酶(PK, abs580073)、乳酸(LA, abs580160)、乳酸脱氢酶(LHD, abs580007)
接下来，小爱就以糖酵解系列试剂盒中的丙酮酸激酶检测试剂盒为例，给大众仔细介绍运用办法。
丙酮酸激酶检测试剂盒运用办法介绍
1、试剂盒组分
2、操作过程：
1、材料和试剂准备
自备材料：酶标仪、蒸馏水、移液器与枪头、研钵、离心机、计时器、湿冰等。
Substrate：运用前加入18mL Reaction Buffer溶解。
Enzyme：运用前加入1mL Assay Buffer 溶解。
Standard：运用前加入1mL蒸馏水溶解，而后取0.2mL加入到0.8mL蒸馏水中，得到浓度为400μmol/L的标准品溶液。
Positive Control：运用前加入0.5mL蒸馏水溶解。
2、样本处理
1）细胞/细菌样本：将细胞/细菌(5×106)收集到离心管中，离心后去掉上清液，加入1mL Assay buffer，超声处理（功率20%，超声3s，间隔10s，重复30次）后于4℃，8000g离心10min，上清液转移至新离心管中，湿冰上保留待检测；
2）组织样本：叫作取1g组织，加入1mL Assay buffer在湿冰上匀浆，4℃，8000g离心10min，上清液转移至新离心管中，湿冰上保留待检测；
3）血清/血液样本：直接检测。
3、上样及检测
上样前将所有试剂加热至37℃，而后根据如下表格加样。
注：
1）针对标准品，可进行2倍连续稀释（6个点上下），制成标准曲线。
2）针对未知的样品，咱们意见挑选几个样品进行预实验，以确定样品浓度和稀释倍数。倘若酶活力较低，请向反应体系中加入更加多的样品，或增多反应时间；倘若酶活力较高，请稀释样品，或减少反应时间。
4、标准曲线
标准曲线仅用于参考，每次实验都必要做一条新的标准曲线。
 检测范围：4μmol/L - 400μmol/L
 降低浓度的阳性对照示例
平常问题解答
Q1：试剂盒中的96-Well Microplate仅有一个，不足实验运用怎么办？
A1：该试剂盒中的96孔板是免费送的，后续实验能够用常规的96孔酶标板代替。
Q2：试剂盒操作说明书中既有标准曲线法又有公式法，我应该选取哪种计算方式？
A2：两种方式任选一种就能够，公式是简便算法，意见根据标曲计算，会更加准确。必须重视的是，运用标准曲线法，每次实验必要重新绘制标准曲线。
Q3：试剂盒中的阳性对照必须和标准曲线同样每次都做吗？
A3：阳性对照不必须每次都做，能够在首次实验时做以帮忙您确认试剂盒可否有问题。当然，亦有老师每次做实验都会做阳性对照，以便在实验数据不正常时排查实验哪里出了问题。
参考文献
[1] 杨柳易,王琛.有氧糖酵解对肾脏疾患影响的科研发展[J].中国中西医结合肾病杂志, 2022,23(8):744-746.
[2] Chang L, Li G, Jiang S, et al. 1-Pyrroline-5-carboxylate inhibit T cell glycolysis in prostate cancer microenvironment by SHP1/PKM2/LDHB axis[J]. Cell Commun Signal. 2024;22(1):101. Published 2024 Feb 8. doi:10.1186/s12964-024-01493-1
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发表于 2024-5-25 04:35:36
