[IF:5.4]八珍汤经过促进G-四链体分解和端粒伸长挽救早衰样细胞衰老的功能

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“气血双补八珍汤，四君四物合成方，煎加姜枣调营卫，气血亏虚服之康。”

摘要

民族药理学关联性

八珍汤是治疗衰老关联疾患运用最广泛的中药 （TCM） 处方之一。然而，因为成份的繁杂性，八珍汤的药理机制仍然有限。

科研目的

本科研旨在助力中医临床精细医学的发展，尝试系统分析解剖繁杂中药方剂八珍汤的分子机制。经过系统分析，咱们确定了八珍汤在端粒伸长中的药理机制。

材料与办法

经过对八珍汤处理的野生型细胞进行RNA测序和转录组分析，揭示了八珍汤诱导的转录组谱。咱们利用了来自Werner综合症（WS）小鼠的细胞，因为DNA解旋酶Wrn的缺乏，已知该小鼠的端粒伸长功能失调。经过Western blot、qPCR、免疫荧光、流式细胞术、端粒FISH和SA-β-Gal染色，验证转录组数据，确认八珍汤及其含药血清在端粒伸长和逆转早衰细胞衰老中的药理功能。

结果

咱们发掘，八珍汤能够系统地调节多种抗衰老途径，包含干细胞调节、蛋白质稳态、心血管功能、神经元功能、抗炎、抗DNA损害诱导的应激、DNA解旋酶活性和端粒延长。咱们发掘八珍汤及其含药品血清能够上调多种DNA解旋酶和端粒调节蛋白。DNA解旋酶的增多促进了G-四链体（G4）结构的解析，并促进了DNA复制和端粒伸长。这些改进还赋予了细胞对复制应激诱导的DNA损害的抵抗力，并挽救了WS导致的细胞衰老。

结论

这些数据一起显示，八珍汤上调DNA解旋酶的表达，从而促进G4的分解和端粒的维持，从而挽救早衰细胞衰老并有助于其抗衰老特性。咱们的数据揭示了八珍汤经过延长端粒在抗衰老关联疾患中的新的分子机制，这可能为八珍汤在端粒侵蚀导致的多种退行性疾患中的应用供给启示。

关键字 八珍汤 转录组 DNA 解旋酶 端粒 G-四链体

2. 材料与办法

2.1.八珍汤的制备

八珍汤的配方如下：人参C.A.Mey。30 克，熟地黄 （Gaertn.）DC. 30 g，芍药 pall.30 克、川芎 30 克、茯苓 （Schw.） 狼 30 克、当归 （Oliv.）Diels 30 g，Atractylodes macrocephala Koidz 30 g，Glycyrrhiza uralensis Fisch 30 g。这些草药由贵州中医药大学第二附庸医院开具（批号：20211020HU）。将草药浸泡在800 mL蒸馏水中，浸泡3 h，煮沸两次，得水提液。将提取物合并、过滤并浓缩至 0.6 g/mL。将最后溶液超声处理并离心（3000rmp，15min），收集上清液，用0.45μM膜过滤，等分试样，并储存在-20°C中。出于质量掌控的目的，咱们进行了HPLC以得到八珍汤的化学指纹图谱。参比药剂按八珍汤成份中常用药剂选取（弥补图1）。

为保证八珍汤在无毒剂量范围内运用，咱们应用CCK8测定八珍汤处理后的细胞活力。简言之，用连续浓度的八珍汤处理野生型MEFs24 h，并用CCK8检测试剂盒（Sangon Biotech）测定细胞活力。

2.2. MEF细胞培养和处理

所有小鼠实验方法均已得到贵州医科大学动物护理和运用委员会（2200057）的准许。WT（野生型）和G3DCO（G3mTerc−/−Wrn−/−）在e13.5天内收获，并在含有10%胎牛血清（FBS）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中培养，在37°C和5%CO2和 3% O2.在第 5 代之前运用 MEF 进行实验，细胞以 1：2 或 1：3 的比例传代。

用八珍汤（对照，低剂量（10 μg/mL）、高剂量（20 μg/mL））处理培养细胞48h。针对 G4 结构稳定剂处理，用 5 μM 盐酸吡啶他丁 （PDS） （MCE） 处理细胞 24 小时。八珍汤和PDS联合处理，用八珍汤（对照，低剂量（10μg/mL），高剂量（20μg/mL））处理细胞24h，而后加入5μM PDS，继续处理24h。

2.3.含药血清的制备

大鼠用药方法已得到贵州医科大学动物护理和运用委员会（2200058）的准许。6-8周龄雄性SD大鼠随机分为八珍汤组和对照组，每组8只。八珍汤组大鼠以12.6 g/公斤的剂量注胃注射八珍汤，对照组每日1次腹腔注射等体积生理盐水，连续7 d。第7天，末次给药后2 h，腹腔注射1%戊巴比妥钠，取血样制成含药血清。将同一组大鼠的血清混合，在56°C下灭活30分钟，用0.22μm膜过滤，并在4°C或-80°C下储存以备后用。

2.4. RNA测序（RNA-seq）和转录组数据分析

WT细胞用八珍汤（对照，低剂量（10 μg/mL）、高剂量（100 μg/mL））处理24h。这些细胞被收获并送去进行RNA-seq的商场服务。针对每一个样品，收集20G的RNA-seq数据进行进一步分析。数据由 EdgeR 运用样本内归一化 （https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html） 进行归一化。

进行单样本基因集富集分析（ssGSEA）（Subramanian等人，2005）以分析RNA-seq以得到信号通路的分数。来自分子特征数据库（Liberzon等人，2011）的C2和C5基因集被用作ssGSEA分析的通路数据库（https://www.genepattern.org/）。用Morpheus（https://software.broadinstitute.org/morpheus）绘制了顶部差异调控通路，以得到八珍汤调控的转录组谱。

2.5. 蛋白质印迹

收获用/不消八珍汤处理的细胞，并在含有蛋白酶控制剂混合物（罗氏）的RIPA缓冲液中裂解。经过SDS-PAGE分离含有20 μg总蛋白的细胞裂解物，并将其转移到PVDF膜上。在室温下封闭膜在10%脱脂牛奶中的非特异性结合1小时，而后在4°C下与一抗孵育过夜，然后在室温下将辣根过氧化物酶标记的二抗孵育1小时，并用ECL观察。运用的重点抗是抗 Blm（1：1000，Invitrogen）、抗 Recql4（1：1000，Invitrogen）、抗 Pot1（1：1000，Invitrogen）、抗 Terf1（1：1000，Invitrogen）、抗 Mcm7（1：1000，Santa Cruz）、抗 Parp1（1：1000，Abcam）、抗 p53（1：5000，Proteintech）、抗 Rb（1：1000，BD pharmingen）、抗 p130（1：1000，Abcam）、抗 E2F1（1：1000，Novus）、抗 Cdc2（1：1000，CST）、抗 Cdk2（1：1000，CST）、抗肌动蛋白（1：1000，Santa Cruz）。

2.6. qPCR检测

经过Trizol分离用/不消八珍汤处理的细胞的RNA，而后用RNeasy Mini试剂盒（Qiagen）纯化。从RNA逆转录cDNA，并按照制造商的说明（Applied Biosystems）在ABI Prism 7300序列检测系统上运用SYBR-Green PCR预混液进行qPCR。运用的引物如下：

Blm-F：AGCGACACTCAGCCAGAAAAC，

Blm-R：GCCTCAGACACGTTCACATCTT;

Recql4-F：CTCTACCGTGAGTACCGTAACCTAA，

Recql4-R：AGTAGGCTCTGTTTTGGCATAGACT;

Parp1-F：GGTCTTTAAGAGCGACGCTTAT， 

Parp1-R：TTCTGTGTCTTGACCATGCAC;

Mcm7-F:AGTATGGGACCCAGTTGGTTC, 

Mcm7-R:GCATTCTCGCAAATTGAGTCG;

Terf1-F：CAGCAGTCTACAGAAACTGAACC， 

Terf1-R：ACTGAAATCTGATGGAGCACG;

GAPDH-F：GGTTGTCTCCTGCGACTTCA， 

GAPDH-R：TGGTCCAGGGTTTCTTACTCC.

2.7. SA-β-Gal染色

如前所述进行SA-β-Gal染色（Dimri等人，1995）。简而言之，将培养的细胞固定并在37°C下对SA-β-半乳糖苷酶活性进行4小时染色。

2.8. 流式细胞术检测

针对细胞周期分析，收获细胞并将其固定在冰冷的 70% 乙醇中过夜。固定后，用 1X PBS 基碘化丙啶溶液（50 μg/mL PI、100 μg/mL RNase A、0.1% 柠檬酸钠、0.1% Triton X-100）对细胞进行染色，并经过流式细胞术 （Agilent） 进行分析。

2.9. 免疫荧光

将盖玻片上培养的细胞用2%多聚甲醛和2%蔗糖在1×PBS中固定10分钟，而后用1%NP-40透化。用 5% BSA/PBS 阻断非特异性结合后，将细胞与一抗一块孵育，而后与二抗在室温下在 1% BSA/PBS 中孵育 1 小时。而后用含有抗褪色封固剂（Solarbio）的DAPI封片载玻片。运用的一抗是抗γH2AX（1：1000，Abcam），抗DNA G-四链体（G4）抗体，克隆1H6（1：200，Merck），抗Blm（1：200，Invitrogen），抗Recql4（1：200，Invitrogen）。

2.10. 端粒测定

免疫荧光联合荧光原位杂交 （IF-FISH）：用八珍汤（对照，低剂量 （10 μg/mL）、高剂量 （20 μg/mL））处理在盖玻片上培养的细胞 48 小时。在 1 × PBS 中洗涤 3 次后，将细胞在 2% 蔗糖和 2% 多聚甲醛中固定 10 分钟，而后用 0.5% NP-40 透化。封闭溶液（2%明胶和0.5%BSA在1×PBS中）在室温下孵育1小时后，将一抗在4°C下施用过夜。而后将细胞与二抗在室温下孵育1小时。在 1 × PBST 中洗涤 3 次后，将细胞在室温下用 4% 多聚甲醛固定 10 分钟，并与端粒 PNA-FISH 探针 5′-FITC-green-（TTAGGG）-3′ （Panagene） 杂交。冲洗盖玻片并用含有抗褪色封固剂的DAPI复染（Solarbio）。IF-FISH的一抗：抗Recql4（1：200，Invitrogen），抗Blm（1：200，Invitrogen）。

端粒DNA qPCR测定：培养的细胞（1×105细胞/孔在 6 孔板中）用八珍汤（对照，低剂量 （10 μg/mL）、高剂量 （20 μg/mL））处理 48 小时。而后将细胞传代 6 次 （1 × 105细胞/孔在 6 孔板中），并继续进行八珍煎剂处理。收获第 7 代细胞，纯化基因组 DNA 用于基于 Syber green 的 qPCR。端粒DNA引物序列为：正向：5′-CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTGT-3′，反向：5′-GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCT-3。参考36B4 DNA引物序列为：正向：5′-ACTGGTCTAGGACCCGAGAAG-3′，反向：5′-TCAATGGTGCCTCTGGAGATT-3。

3. 结果

3.1. 应用八珍汤诱导的细胞转录组谱揭示了其抗衰老的系统功能

为了得到八珍汤调控分子通路的完整图像，咱们将RNA测序（RNA-seq）技术应用于有或无八珍汤处理的细胞。因为许多细胞系在永生化过程中携带多个基因突变，这可能会改变受影响的分子通路对八珍汤的反应，咱们利用原代培养的野生型小鼠胚胎成纤维细胞（WT MEF）得到了八珍汤诱导的细胞转录组。

为保证八珍汤在无毒剂量范围内的应用，咱们进行了CCK8实验，以测试八珍汤处理系列剂量后的细胞活力。CCK8数据显示，八珍汤在1 μg/mL至100 μg/mL的剂量范围内未表示出细胞毒性，乃至在10 μg/mL时表示出细胞活力增多（弥补图2）。因此呢，咱们选取低剂量为10 μg/mL，高剂量为100 μg/mL进行转录组谱分析。用低剂量（10 μg/mL，BZT-L）和高剂量（100 μg/mL，BZT-H）八珍汤处理后，将WT MEFs用于RNA-seq。对数据进行归一化，经过单样本基因集富集分析（ssGSEA）进行分析，得到八珍汤激活（上调）或控制（下调）的细胞通路。

绘制了八珍汤调控前50条通路的热力图（图1）。在顶部上调通路中，咱们发掘了干细胞通路，以及已知在干细胞调控中很重要的Wnt-B-Catenin通路。咱们还发掘烟酰胺代谢途径，已知对Sirtuins蛋白质功能和线粒体功能至关重要（Houtkooper等人，2012），被八珍汤激活（图1）。

有趣的是，咱们的数据揭示了八珍汤上调与蛋白质糖基化关联的多种途径，蛋白质质量掌控和ER功能（图1），如糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定蛋白质合成、蛋白质糖基化、ER关联蛋白质降解途径、未折叠蛋白质的伴侣。这些途径针对维持蛋白质稳态、减少内质网应激和细胞凋亡至关重要。蛋白质稳态的下调已作为衰老的标志之一（Lopez-Otin等人，2013）。

非常有趣的是，咱们发掘八珍汤（图1）上调了神经元功能关联通路，包含突触囊泡内吞功效的过程，即感觉功能。已知这些途径的下调是神经元退行性疾患的症状。

与八珍汤的原始功能之一（滋养造血系统）一致，咱们发掘淋巴内皮通路中的VEGFR3信号被激活，血红蛋白降解通路下调。除此之外，血管紧张素转换和醛固酮合成（ACE）控制剂通路亦上调，这可能有助于加强心血管系统的健康（图1）。为了弥补这一发掘，咱们还发掘对 SARS-COV-2 的转录反应已下调（图 1）。因为发掘 ACE2 是 SARS-COV-2 的受体，这些数据显示八珍汤能够经过影响 ACE 蛋白来阻断 SARS-COV-2。

在这些下调通路中，发掘了多种炎症反应通路，包含TNFR2、IL4、IL2、IL3、TNFR1信号通路、促肾上腺皮质激素释放激素等（图1）。有趣的是，MAPK关联信号通路亦被下调，包含FCER1、TPO、甘丙肽受体、冠状病毒MAPK信号通路等（图1）。已知MAPK关联途径会诱导对应激的炎症反应，例如DNA损害、缺氧、氧化应激、病毒感染等。MAPK通路的激活是一种双刃剑事件。与此一致，氧化应激途径亦被下调（图1）。

虽然咱们观察到p53调节的细胞周期阻滞和半胱天冬酶通路（图1）被低剂量的八珍汤下调，但咱们亦观察到几种肿瘤出现通路的下调，如慢性粒细胞白血病、子宫内膜癌、胰腺癌通路等（图1）。

令人惊讶的是，雷帕霉素（TOR）信号转导的靶标亦被下调（图1），其控制功效广泛应用于抗衰老和抗肿瘤药品筛选。

这些数据一起揭示了八珍汤的抗衰老功能能够经过系统调控多种抗衰老途径来实现，包含干细胞调控、维持蛋白质稳态、促进心血管功能、改善神经元功能、抗炎、抗DNA损害诱导的应激等。

3.2. 八珍汤的应用经过上调DNA解旋酶和端粒蛋白激活端粒维持途径

众所周知，端粒功能可能是干细胞功能、抗炎、抗DNA损害诱导应激等的维持机制，但因为端粒维持途径中基因丰度低，可能没法作为转录组中最重要的途径。因此呢，咱们进一步绘制了端粒功能和DNA损害反应关联通路的热图，并试图剖析八珍汤在端粒维持中的功能。有趣的是，咱们发掘端粒末端加工关联途径（如端粒加帽、端粒C链等）对端粒伸长和维持至关重要（图2，A）。端粒DNA修复通路亦上调（图2，A），控制端粒DNA损害诱导的细胞衰老（图2，A）。

咱们还发掘了八珍汤诱导的DNA解旋酶通路的上调（图2，A）。有趣的是，端粒酶通路并未显著受到八珍汤的调控（图2，A），咱们可疑端粒的维持是经过端粒重组的激活（图2，A，经过重组上调端粒维持，下调端粒对DNA重组的控制）。与此一致，DNA损害修复途径亦上调（图2，A）。而八珍汤下调p53调节的细胞周期阻滞通路（图1）。经过GSEA分析进一步比较低剂量八珍汤治疗组与对照组的差异表达基因和通路。结果显示，八珍汤处理后DNA解旋酶活性通路明显上调（图2，B，标叫作p值=0.0068，FDR q值=0.0997）。将差异表达基因绘制在热图中，其中多个DNA复制关联DNA解旋酶、DNA损害修复和端粒关联蛋白上调，如DDX、Mcm、Ercc、Xrcc、Smarca、Blm、Fanc、PolQ等（图2，C）。总之，八珍汤能够促进DNA损害修复和端粒维持，减少DNA复制应激，从而促进细胞周期进程，防止细胞衰老。

为了验证这些数据，咱们利用了来自Werner综合症小鼠的早衰MEF细胞（G3DKO细胞，其中DNA解旋酶Wrn和端粒酶Terc基因都被敲除），WT MEF细胞做为对照。按照CCK8数据（弥补图2）和转录组谱（图1），咱们认识到低剂量（10 μg/mL）的八珍汤在维持细胞生长方面表现出更好的效果，因此呢咱们用10 μg/mL和20 μg/mL八珍汤处理细胞进行进一步实验。Western blot数据表示，八珍汤处理上调了WT和G3DKO细胞中DNA解旋酶Blm、Mcm7的蛋白水平（图2D和E）。已知这些 DNA 解旋酶能够解开 DNA G4 结构，并促进 DNA 复制叉的发展，尤其是在端粒 DNA 复制过程中。端粒蛋白 Parp1 和 Terf1 亦上调，已知它们参与端粒包装和 C 链（滞后链）合成。罢了知参与端粒长度负调控的 Pot1 则下调（图 2D 和 E）。总之，八珍汤可能调节端粒DNA复制和端粒DNA损害反应，从而调节端粒延长。

同期，咱们还观察到，八珍汤对抑癌基因p53蛋白水平无显著影响，而p53下游效应因子p21在WT和G3DKO细胞中均上调（图2F和G）。有趣的是，另一个重要的抑癌因子Rb家族成员Rb和p130，众所周知的细胞周期控制剂，被八珍汤上调。而下游的Rb通路E2F1亦被上调，这应该是细胞周期起步子。这些数据显示，经过八珍汤（图2D-G）对细胞周期进程进行双面调节，能够保证非致瘤性细胞周期进程。qPCR结果还表示，在WT和G3DKO细胞中，八珍汤处理后DNA解旋酶和端粒关联蛋白Recql4、Blm、Mcm7、Parp1、Terf1均上调（图2H和I），并进一步验证了Western blot揭示的这些蛋白的上调。

综上所述，八珍汤可上调DNA解旋酶的表达，促进G4结构的解旋，从而促进DNA复制，尤其是端粒DNA复制。

图 2.八珍汤经过上调DNA解旋酶的表达，激活DNA解旋酶和端粒维持途径。一个。八珍汤上调DNA解旋酶和端粒维持通路。B.低剂量八珍汤处理 （BZT-L） 与对照组的 GSEA 分析。低剂量八珍汤处理后DNA解旋酶活性通路明显富集（上图）。富集图（下图）显示DNA解旋酶活性途径中触及的基因富集。C.基因的热图差异表达，并有助于B.D.解旋酶活性富集数据。八珍汤处理后，WT细胞或G3DKO细胞中DNA解旋酶Blm、Mcm7和端粒蛋白Parp1、Terf1的蛋白水平上调，端粒蛋白Pot1下调。E.D.F.的量化八珍汤处理后，WT细胞或G3DKO细胞中细胞周期控制剂p21、Rb、p130的蛋白水平上调，细胞周期起步子E2F1亦上调。G.F.H.的量化qPCR结果表示，八珍汤处理后WT细胞中DNA解旋酶Recql4、Blm、Mcm7和端粒蛋白Parp1、Terf1上调。I.qPCR结果表示，八珍汤处理后G3DKO细胞中DNA解旋酶Recql4、Blm、Mcm7和端粒蛋白Parp1、Terf1上调。

3.3. 八珍汤促进DNA解旋酶募集到G4，减少G4结构的存在，并赋予细胞对DNA复制胁迫的抵抗力

鉴于用八珍汤处理的细胞中DNA解旋酶的增多，咱们进一步科研了这些DNA解旋酶是不是有助于解开G4结构，以及这可能怎样影响DNA复制应激。

咱们首要运用抗G4抗体检测八珍汤处理前后G3DKO细胞中G4结构的量。咱们发掘，八珍汤处理后G4结构信号显著减弱（图3A、B、G4），说明八珍汤处理后G4结构快速消退。同期，DNA解旋酶Recql4（图3，A，Recql4）和Blm（图3，B，Blm）的信号加强，处理后Recql4或Blm信号与G4结构的共定位增多。

这些数据一起显示，八珍汤经过促进 DNA 解旋酶 Recql4 和 Blm 向 G4 DNA 的募集来促进 G4 结构的解析，这可能会减少因为 G4 结构的存在而引起的 DNA 复制应激诱导的 DNA 损害。为了验证这一点，咱们在八珍汤处理前后用其标记物γ-H2AX检测了细胞DNA损害。数据表示，G3DKO细胞中的DNA损害显著（图3，C，对照），这可能是因为Wrn和端粒酶敲除诱导的背景DNA复制应激导致。八珍汤的应用大大降低了γ-H2AX信号，显示早衰细胞复制应激诱导的DNA损害减弱（图3，C，BZT）。

为了进一步证实这些数据，咱们应用吡啶抑素（PDS，一种 G4 稳定剂）来稳定 G4 结构并诱导 DNA 复制应激（DNA 损害）。咱们首要评定了DNA解旋酶蛋白的表达，发掘PDS处理能够下调G3DKO细胞中DNA解旋酶Blm、Recql4、Mcm7、端粒蛋白Parp1和细胞周期蛋白Cdc2、Cdk2，而八珍汤能够挽救这些蛋白的表达（图3D和E）。这些数据显示，八珍汤能够逆转PDS治疗的影响。运用G4抗体，咱们证实，与对照细胞相比，PDS处理稳定并增多了G4结构的数量，而即使在PDS处理存在的状况下，八珍汤亦能够显著减弱G4信号（图3，F，G4）。咱们再次观察到，尽管PDS处理，八珍汤仍促进了Recql4和Blm蛋白的表达及其与G4结构的共定位（图3，F，Recql4，Blm）。而后，咱们检测了PDS在有/无八珍汤诱导的DNA损害。用PDS处理的细胞表示出增多的γ-H2AX信号，显示PDS诱导DNA损害（图3，G，PDS）。而八珍汤的应用显著减弱了PDS诱导的γ-H2AX信号，显示八珍汤能够逆转PDS诱导的G4稳定和DNA复制应激的影响（图3，G，PDS+BZT）。

以上数据显示，八珍汤经过减少DNA复制应激在细胞周期进程中的功效。而后，咱们应用流式细胞术分析八珍汤处理后的细胞周期进程。细胞周期分析显示，八珍汤可轻度促进细胞周期进程，降低G1期细胞百分比，增多S期和G2期细胞百分比（图3，H）。PDS处理还诱导了G2细胞的增多，这可能是因为DNA复制应激导致。有趣的是，八珍汤加PDS的应用再次降低了G1期细胞的百分比，并略微增多了S期和G2期的百分比（图3，H）。这些数据显示，八珍汤对细胞周期进程有轻度调节功效。

总之，这些数据显示，八珍汤能够促进G4结构的分解，并赋予细胞对PDS处理导致的DNA复制应激的抵抗力。这些功能一起加强了细胞周期的质量掌控。

图 3.在G3DKO细胞中，八珍汤上调DNA解旋酶，促进G4结构的分解，减少PDS诱导的DNA损害。一个。八珍汤减弱了G4结构的信号，而Recql4信号上升，观察到Recql4和G4信号的共定位性较多。B.八珍汤减弱了G4结构的信号，而Blm信号上升，能够观察到更加多的Blm和G4信号共定位。C.八珍汤应用降低了G3DKO细胞中DNA损害标志物γ-H2AX的信号。D.在G3DKO细胞中，PDS处理下调DNA解旋酶Blm，Recql4，Mcm7，端粒蛋白Parp1和细胞周期蛋白Cdc2，Cdk2，而八珍汤挽救了这些蛋白的表达。E. D.F.的量化PDS处理稳定了G4信号，下调了DNA解旋酶Recql4和Blm，而PDS联合八珍汤挽救了Recql4和Blm的表达，降低了G4信号。G.PDS处理的细胞γ-H2AX信号上升，而八珍汤的应用显著减弱了PDS诱导的γ-H2AX信号。H.G3DKO细胞流式细胞术分析显示，八珍汤经过降低G1期细胞的百分比，增多S期和G2期的百分比，能够轻度调节细胞周期进程。

3.4. 八珍汤促进早衰样细胞端粒伸长，逆转细胞衰老

以上数据显示，八珍汤可促进G4结构的分离，而G4结构是端粒DNA中丰富的结构，因此呢八珍汤可能有助于端粒DNA的复制和伸长。为了验证这一点，咱们首要进行了免疫荧光和荧光原位杂交（IF-FISH）来检测DNA解旋酶向端粒DNA的募集。IF-FISH数据表示，八珍汤处理后DNA解旋酶Recql4和Blm表达上调（图4A和B，Recql4，Blm）。有趣的是，八珍汤处理后端粒DNA信号明显增多（图4A和B，端粒），DNA解旋酶Recql4与端粒DNA的共定位亦增多（图4，A，端粒和Recql4，白色箭头），与Blm相同（图4，B，端粒和Blm，白色箭头）。

咱们进一步进行了端粒DNA qPCR，比较了八珍汤处理前后端粒DNA的相对长度。结果显示，八珍汤处理后端粒DNA信号明显增多（p < 0.01）（图4，C）。这些数据显示，八珍汤上调DNA解旋酶，促进DNA解旋酶募集到端粒DNA，促进端粒伸长。

为了测试这些早衰细胞中端粒的伸长是不是能够挽救它们的衰老，咱们对有/无八珍汤处理的G3DKO细胞进行了SA-β-Gal染色。咱们发掘，八珍汤能够降低SA-β-Gal染色信号，显示G3DKO衰老的挽救（图4D和E）。

图 4.八珍汤处理拉长了G3DKO细胞的端粒，挽救了早衰样细胞衰老。A. IF-FISH表示，八珍汤处理后DNA解旋酶Recql4上调（Recql4），端粒DNA信号明显增多，Recql4与端粒DNA的共定位增多（端粒和Recql4，白色箭头指向共定位点）。B. IF-FISH表示，八珍汤处理后，解旋酶Blm（Blm）上调，端粒DNA信号明显增多，Blm与端粒DNA的共定位增多（端粒&Blm，白色箭头指向共定位点）。C. qPCR数据表示，八珍汤处理后端粒相对长度明显增多（p < 0.01）。D.八珍汤处理后G3DKO细胞的SA-β-Gal信号显著减弱，提示早衰样细胞衰老的挽救。E.D的量化。

4. 讨论

八珍汤等经典中药方剂已有效应用于治疗与衰老关联的退行性疾患或维持长寿功能。然而，因为这种繁杂的中药体系的药理科研受限，很难评估药理功效和随访临床结果。

系统生物学驱动的组学策略的应用可能有助于理解中药的药理机制，并可能引起发掘新的治疗方向（Guo et al.， 2020;Wu 等人，2019 年）。基于网络药理学的办法已被用于认识丹参（丹参的干燥根茎）对贫血的功效和机制，并揭示了Jak-Stat信号是其功能的关键途径（He等人，2022）。多组学技术已应用于剖析真武不气汤的机制，并揭示了其在调节多种炎症关联通路中的功效，如PI3K-akt、MAPK信号通路和NF-κB信号通路（Zhai et al.， 2022）。已发掘大柴胡汤剂可调节肠道微生物群和谷胱甘肽代谢，如多组学所揭示的那样（Huang 等人，2023年）。系统生物学驱动的组学办法在剖析繁杂中药汤剂的分子机制方面看起来特别有期盼。

在这儿，咱们应用系统的药理学办法对八珍汤进行科研。经过RNA测序和ssGSEA分析，得到了野生型遗传背景下八珍汤调控的转录组谱。这般，咱们能够避免在细胞系创立过程中出现的基因突变导致的信号通路改变。野生型细胞调控八珍汤的转录组图谱揭示了八珍汤对干细胞调控、蛋白稳态、心血管功能、神经元功能、抗炎、抗DNA损害诱导应激等多种抗衰老途径的系统调控功效。该转录组图谱和仔细的信号通路对将来科研八珍汤在各样器官退行性疾患中的干扰功能非常有用。咱们认为，在野生型遗传背景下应用的转录组模式将更适合反映八珍汤处理的真实反应，由于细胞中的任何突变都可能改变通路和细胞反应。以野生型细胞反应为参考，对其他在区别细胞中工作、拥有区别基因突变的人会更有帮忙。

针对以上可能的抗衰老特性，端粒维持可能是维持干细胞功能、防止DNA损害、改善器官功能、抗炎等的平常分子基本。与此一致，咱们对转录组的进一步分析显示，八珍汤处理能够上调DNA解旋酶活性和端粒延长的途径。众所周知，DNA 复制的顺利发展针对端粒维持和细胞周期进程至关重要（Brenner 和 Nandakumar，2022）。然而，染色体脆弱位点包括特殊的 DNA 二级结构，例如端粒 G-四链体 （G4） 结构。这些结构阻碍了复制叉的发展，并引起复制压力（Lezaja 和 Altmeyer，2020年）。DNA解旋酶起步复制起点，经过解开G4结构形成DNA复制叉，保准DNA复制的顺利进行。解旋酶功能缺陷诱导DNA复制应激，激活DNA损害反应途径，并引起衰老或肿瘤出现（Bochman和Schwacha，2009;Zeman 和 Cimprich，2014年）。DNA解旋酶基因的突变引起早衰综合症，如Werner综合症（Wrn基因突变）（Epstein et al.， 1966）、Bloom综合症（Blm gene突变）（German et al.， 1965）、Rothmund-Thomson综合症（Recql4基因突变）（Kitao et al.， 1999）等。因此呢，DNA解旋酶活性和端粒延长途径的上调可能是八珍汤抗衰老特性的最重要机制之一。

为进一步认识八珍汤对DNA解旋酶和端粒的调控功效，以Werner综合症小鼠早衰样细胞为科研对象，验证了八珍汤对DNA解旋酶Blm、Recql4、Mcm7和端粒调节蛋白Parp1、Terf1的调控功效。端粒守护蛋白Pot1在八珍汤水提液直接处理时下调，而在含药品血清处理时上调。科研显示，解旋酶 Blm 对解开 G4 结构拥有很强的活性，并且针对端粒 DNA 前导链的合成很重要（Drosopoulos 等人，2015 年）。已然发掘解旋酶 Fancm、Brca1 和 Blm 调节 DNA 末端加工和同源重组（Pan 等人，2017年）。还发掘 Blm 蛋白能够促进 Holiday 连接的解析，并且 Recql4 蛋白能够帮忙 DNA 双链断裂修复和端粒 DNA 维持（Ghosh 等人，2012 年）。科研显示，Terf1 能够与 Blm 合作改善端粒滞后链 DNA 合成，从而淬灭端粒复制过程中出现的 DNA 损害诱导的 ATR 信号传导（Bianco 等人，2019年）。Pot1已被证明与端粒单链DNA结合并守护端粒免受DNA损害反应，并且很可能控制端粒的伸长（de Lange，2018;Denchi 和 de Lange，2007 年）。同期还发掘 Pot1 能够破坏端粒 G4 并在体外促进端粒酶扩展（Zaug 等人，2005）。因此呢，咱们推测八珍汤对这些DNA解旋酶和端粒蛋白的上调会影响G4 DNA和端粒伸长。经过应用G4抗体和G4稳定剂PDS，验证了八珍汤能够促进G4结构的分解，赋予细胞对复制应激诱导的DNA损害的抵抗力，促进细胞周期的质量掌控，促进端粒伸长。

咱们还揭示了八珍汤能够挽救Werner综合症小鼠模型中早衰样细胞的细胞衰老。咱们的数据显示，八珍汤有可能治疗遗传性早衰综合症，尤其是哪些有端粒功能阻碍的人。事实上，有些大夫已然运用八珍汤来治疗再生阻碍性贫血（Fang，2012;Zhu， 2015）。遗传性再生阻碍性贫血是因为端粒酶反常（例如，先天性角化不良综合症）或 DNA 解旋酶（例如，Fanconi 贫血）功能（Bhandari 等人，2022 年;Grill 和 Nandakumar，2021 年）。而散发性再生阻碍性贫血的病因重点是造血干细胞的DNA损害。进一步科研Werner综合症小鼠模型，评估八珍汤对器官衰老及关联疾患的功效。

令人惊讶的是，从转录组图谱中，咱们还揭示了八珍汤可用于预防和治疗 COVID-19。有趣的是，已知 COVID-19 会损害消化功能和心血管功能，这是八镇汤的两个靶点（四骏子汤守护消化功能，四雾汤守护心血管功能）。抗炎特征亦可能有助于 COVID-19 治疗。

总之，咱们的数据供给了八珍汤调节的可能途径的完整图像。转录组分析揭示的特征通路比单个基因变异更准确、更稳定，可做为中医系统的生物标志物。随着临床科研的深入，这些中药方剂关键信号通路可在必定程度上应用于临床药理效果的定量评估，并阐明经典长寿方剂在衰老关联疾患防治中的功效和分子机制，以指点中医药临床精细治疗。

DNA 复制应激和端粒侵蚀是衰老关联疾患的基本问题（Rossiello 等人，2022 年;Zeman 和 Cimprich，2014年）。探索拥有端粒维持活性的天然产物是抗衰老行业最活跃的专题之一。环黄芪酚以其在端粒酶激活和端粒伸长中的活性而闻名（Liu等人，2017）。因此呢，发掘八珍汤应用能够作为处理DNA复制应激和端粒侵蚀的一种非常安全有效的策略，从而有利于衰老关联疾患的治疗，这是非常令人兴奋的。

5. 结论

转录组图谱表示，八珍汤可能系统调控多种抗衰老途径，包含干细胞调控、蛋白稳态、心血管功能、神经元功能、抗炎、抗DNA损害诱导的应激、DNA解旋酶活性和端粒延长。咱们的数据揭示了一种识别中药药理学特征通路的新策略，有助于中医临床精细医疗。实验数据证实，八珍汤可上调多种DNA解旋酶和端粒调节蛋白，促进G-四链体（G4）结构的解析，促进DNA复制和端粒伸长，赋予细胞对复制应激诱导的DNA损害的抵抗力，挽救早衰细胞衰老。这些数据为咱们供给了运用八珍汤治疗DNA复制应激和端粒侵蚀关联退行性疾患的潜能。

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你的见解真是独到，让我受益良多。

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