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2021 年 1 月，华中科技大学同济医学院附庸协和医院章小平教授为通讯作者，在 Clinical and Translational Medicine (IF: 7.919) 杂志发布了题为“NNT‐induced tumor cell “slimming” reverses the pro‐carcinogenesis effect of HIF2a in tumors”的科研论文，报告了 NNT 诱导的肿瘤细胞“瘦化”在肿瘤发展中的功效机制。2019 年该课题组在 Advanced Science (IF: 15.840) 上首次提出肿瘤细胞“瘦化”的新概念，本科研是这里前基本上的进一步深入。
协和医院熊之勇博士、熊薇博士、肖文博士为文案一起第1作者。文案中转录组测序和分析由欧易生物帮助完成。
科研背景
肾透明细胞癌（ccRCC）的重点特征是缺氧诱导因子 HIF 的激活和细胞内脂滴 LD 的累积。其中 HIF2a 是直接促进肿瘤细胞增殖和代谢改变的癌基因。
脂质褐化指的是由储存能量的白色脂肪组织向产生能量的棕色脂肪组织转化的过程。肿瘤中亦能够出现类似的脂质褐变过程，引起肿瘤细胞中 LD 的明显消耗，控制肿瘤发展，这一过程被叫作之为“肿瘤瘦化”。但肿瘤“瘦化”的调控和激活机制尚不清楚。
本科研的目的是揭示肾透明细胞癌中 HIF2a、LD 和肿瘤“瘦化”三个重要原因之间的联系，阐明肾透明细胞癌代谢反常的新机制，为肾透明细胞癌新药研发供给依据。
科研内容
基于 HIF2a 敲除后的转录组测序数据和三个独立的线粒体代谢关联基因组的筛选显示，烟酰胺核苷酸转氢酶 (NNT) 是 HIF2a 和肿瘤细胞“瘦化”之间的媒介。进一步的科研显示，NNT 拥有明显的预后预测价值，并且在肾细胞癌中下调。它受 HIF2a 调节，能明显激活脂质褐化介导的肿瘤细胞“瘦化”。机制科研显示，HIF2a 经过与 miR-455-5p 起步子中 HIF2a 关联的应答元件结合而加强 miR-455-5p 的表达，MiR-455-5p 起步子经过与其 3’-UTR 结合而控制 NNT 表达。
科研结果
1. NNT 在 ccRCC 中下调表达并且预示预后不良
ccRCC 的特点是代谢重编程，而线粒体是介导多种代谢过程的要紧细胞器。为了阐明 ccRCC 中代谢反常的机制，对 HIF2a knockdown 转录组测序结果与 3 个线粒体代谢关联基因集取交集，筛选到 2 个基因（图 A）。进一步qPCR 和 western blot 实验证实，ccRCC 组织和细胞系中 NNT mRNA 和蛋白水平均出现明显下降（图 E-H）。结合 TCGA 数据分析表示，NNT 在 ccRCC 中表达明显降低，并且 NNT 的高表达与存活时间正关联（图 B-D）。NNT 能够做为中国 ccRCC 独立预后预测因子。
NNT 在 ccRCC 中下调表达并且预示预后不良
2. NNT 控制 ccRCC 肿瘤发展
为了科研 NNT 的功效，在 ccRCC 细胞系 A498 和 786-0 中分别对 NNT 进行过表达和 knockdown（图 A、E）。结果表示过表达 NNT 后，ccRCC 细胞增殖能力、细胞迁移和侵袭能力均明显降低（图 B-D）。与之关联，NNT knockdown 后，ccRCC 细胞增殖能力、细胞迁移和侵袭能力均明显加强（图 F-H）。显示 NNT 能够控制 ccRCC 的肿瘤发展。
NNT 控制 ccRCC 肿瘤发展
3. NNT 是影响 ccRCC 脂质积聚的重要分子
脂质代谢反常是 ccRCC 的一大特征。GSEA 数据分析显示，NNT 参与了 TCA 循环、脂肪酸代谢、脂质/脂蛋白代谢等通路，因此呢 NNT 能够会对 ccRCC 的脂质代谢有影响（图 A）。油红 O 染色表示，NNT 过表达的 ccRCC 细胞中脂质累积明显减少，而 NNT knockdown 细胞中脂质累积明显增多（图 B-C），甘油三酯定量结果与此类似（图 D-E）。显示 NNT 是调节 ccRCC 中脂质累积的重要因子。
NNT 是影响 ccRCC 脂质积聚的重要分子
4. NNT 经过激活脂质褐化介导的肿瘤细胞“瘦化”以减轻 ccRCC 中脂质蓄积
肿瘤细胞“瘦化”是一个新的概念，它能够有效消耗肿瘤脂质，并明显控制肿瘤发展，而不产生ATP。肿瘤细胞“瘦化”是由于肿瘤中与 PPAR 信号通路关联的脂质褐变介导的，并且出现于线粒体中。GSEA 分析显示，NNT 在线粒体、呼气电子传递和 PPAR 信号通路中均明显富集（图 A），因此呢有理由相信 NNT 与肿瘤细胞“瘦化”相关。
TCGA 数据分析表示，NNT 与脂质褐化的重要 marker 基因 PGC1A 和 UCP1 表达呈现正关联（图 B-C）。qPCR 和 western blot 实验表示，脂质褐化 marker 基因在过表达 NNT 的 ccRCC 细胞中表达明显提升，在 NNT knockdown 细胞中表达明显下降（图 D-G）。免疫荧光染色亦表示，过表达 NNT 的 ccRCC 细胞中脂质积聚显著减轻，并伴同脂质褐化水平的增多（图 H）。以上结果显示，NNT 能够经过诱导脂质褐化介导的肿瘤细胞“瘦化”来实现 ccRCC 中的脂质消耗。
NNT 经过激活脂质褐化介导的肿瘤细胞“瘦化”以减轻 ccRCC 中脂质蓄积
5. NNT 介导的肿瘤细胞“瘦化”逆转 HIF2a 在 ccRCC 中的促癌功效
进一步科研 NNT 与 HIF2a 的调控关系。结果表示，同期 knockdown NNT 能够明显缓解由 HIF2a knockdown 所导致的对 ccRCC 细胞增殖、细胞迁移和侵袭的控制功效（图 B-C），以及由 HIF2a knockdown 所介导的脂质代谢过程、脂质褐化过程（图 D）。综上，NNT 介导的肿瘤细胞“瘦化”能够逆转 HIF2a 在 ccRCC 中的致癌功效，能够认为是 HIF2a 的要紧下游因子。
NNT 介导的肿瘤细胞“瘦化”逆转 HIF2a 在 ccRCC 中的促癌功效
6. HIF2a 经过 miR-455-5p 调控 NNT 的表达
HIF2a 做为转录因子，一般应该促进下游基因的转录，但 HIF2a 与 NNT 表达呈相反趋势（图 A-B），推测两者之间不是直接调控关系。筛选在 HIF2a knockdown 转录组测序结果中表达量下降、同期拥有 NNT 结合能力的 miRNA，仅有一个 miR-455-5p（图 C）。miR-455-5p 在 ccRCC 中高表达量，并且 HIF2a 与 miR-455-5p 表达量正关联、miR-455 与 NNT 表达量负关联（图 D-F）。
在 ccRCC 中上调 miR-455-5p 表达量，伴同 NNT 表达量的下降；在 ccRCC 中对 miR-455-5p knockdown，NNT 表达量随之提升（图 G）。并且 miR-455-5p 表达量的上调，能够挽救因为 HIF2a knockdown 所导致的 NNT 的提升（图 H）。荧光素酶报告系统证实，miR-455-5p 能够直接靶向结合到 NNT 的 3’-UTR 位置（图 I）。
分析表示在 miR-455-5p 转录初始位置上游 2000 bp 内有 3 个 HIF2a 的结合位点，ChIP 实验和荧光素酶报告实验证实，HIF2a 能够直接结合到 miR-455-5p 起步子（图 J-K）。综上可知，HIF2a 能够经过结合到 miR-455-5p 起步子促进其表达，而表达出来的 miR-455-5p 能够靶向结合到 NNT 的 3’-UTR 位置控制 NNT 表达。
HIF2a 经过 miR-455-5p 调控 NNT 的表达
7. NNT 介导的肿瘤细胞“瘦化”控制 ccRCC 的身体发展
接下来在身体水平验证以上科研结论。对裸鼠皮下注射法构建 NNT 过表达的异种控制瘤。结果表示，过表达 NNT 后肿瘤的体积和重量都有明显减小（图 A-B）、脂质褐化标记物表达水平明显上升、肿瘤恶性标记物表达水平明显降低（图 C）、脂质累积减少（图 E），显示 NNT 过表达明显控制了肿瘤恶性程度并促进了身体脂质褐化。尾静脉转移模型结果表示，NNT 过表达降低了肿瘤细胞的肝转移（图 D）。
NNT 介导的肿瘤细胞“瘦化”控制 ccRCC 的身体发展
科研结论
本科研创立了一个新的模型，其中 HIF2a 经过与 miR-4555p 起步子区中 HIF2a 关联的应答元件结合来增多 miR-455-5p 的表达，miR-455-5p 经过与其 3’-UTR 结合来控制 NNT 表达。另外，NNT 促进脂质褐化，使活性肿瘤细胞“瘦化”，从而控制细胞癌的发展。
参考文献
Xiong Z, Xiong W, Xiao W, et al. NNT-induced tumor cell "slimming" reverses the pro-carcinogenesis effect of HIF2a in tumors. Clinical and Translational Medicine 2021; 11(1): e264.
END
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发表于 2024-6-15 17:42:59
