[IF:5.4]八珍汤经过促进G-四链体分解和端粒伸长挽救早衰样细胞衰老的功能
<h2 style="color: black; text-align: left; margin-bottom: 10px;"><span style="color: black;">“</span><span style="color: black;">气血双补八珍汤,四君四物合成方,煎加姜枣调营卫,气血亏虚服之康。</span>”</h2>
<h2 style="color: black; text-align: left; margin-bottom: 10px;"><span style="color: black;">摘要</span></h2>
<h3 style="color: black; text-align: left; margin-bottom: 10px;">民族药理学<span style="color: black;">关联</span>性</h3>
<p style="font-size: 16px; color: black; line-height: 40px; text-align: left; margin-bottom: 15px;">八珍汤是治疗衰老<span style="color: black;">关联</span><span style="color: black;">疾患</span><span style="color: black;">运用</span>最广泛的中药 (TCM) 处方之一。然而,<span style="color: black;">因为</span><span style="color: black;">成份</span>的<span style="color: black;">繁杂</span>性,八珍汤的药理机制仍然有限。</p>
<h3 style="color: black; text-align: left; margin-bottom: 10px;"><span style="color: black;">科研</span>目的</h3>
<p style="font-size: 16px; color: black; line-height: 40px; text-align: left; margin-bottom: 15px;">本<span style="color: black;">科研</span>旨在助力中医临床<span style="color: black;">精细</span>医学的发展,尝试系统分析解剖<span style="color: black;">繁杂</span>中药方剂八珍汤的分子机制。<span style="color: black;">经过</span>系统分析,<span style="color: black;">咱们</span>确定了八珍汤在端粒伸长中的药理机制。</p>
<h3 style="color: black; text-align: left; margin-bottom: 10px;">材料与<span style="color: black;">办法</span></h3>
<p style="font-size: 16px; color: black; line-height: 40px; text-align: left; margin-bottom: 15px;"><span style="color: black;">经过</span>对八珍汤处理的野生型细胞进行RNA测序和转录组分析,揭示了八珍汤诱导的转录组谱。<span style="color: black;">咱们</span>利用了来自Werner<span style="color: black;">综合症</span>(WS)小鼠的细胞,<span style="color: black;">因为</span>DNA解旋酶Wrn的缺乏,已知该小鼠的端粒伸长功能失调。<span style="color: black;">经过</span>Western blot、qPCR、免疫荧光、流式细胞术、端粒FISH和SA-β-Gal染色,验证转录组数据,确认八珍汤及其含药血清在端粒伸长和逆转早衰细胞衰老中的药理功能。</p>
<h3 style="color: black; text-align: left; margin-bottom: 10px;">结果</h3>
<p style="font-size: 16px; color: black; line-height: 40px; text-align: left; margin-bottom: 15px;"><span style="color: black;">咱们</span><span style="color: black;">发掘</span>,八珍汤<span style="color: black;">能够</span>系统地调节多种抗衰老途径,<span style="color: black;">包含</span>干细胞调节、蛋白质稳态、心血管功能、神经元功能、抗炎、抗DNA<span style="color: black;">损害</span>诱导的应激、DNA解旋酶活性和端粒延长。<span style="color: black;">咱们</span><span style="color: black;">发掘</span>八珍汤及其含<span style="color: black;">药品</span>血清<span style="color: black;">能够</span>上调多种DNA解旋酶和端粒调节蛋白。DNA解旋酶的<span style="color: black;">增多</span>促进了G-四链体(G4)结构的解析,并促进了DNA复制和端粒伸长。这些改进还赋予了细胞对复制应激诱导的DNA<span style="color: black;">损害</span>的抵抗力,并挽救了WS<span style="color: black;">导致</span>的细胞衰老。</p>
<h3 style="color: black; text-align: left; margin-bottom: 10px;">结论</h3>
<p style="font-size: 16px; color: black; line-height: 40px; text-align: left; margin-bottom: 15px;">这些数据<span style="color: black;">一起</span><span style="color: black;">显示</span>,八珍汤上调DNA解旋酶的表达,从而促进G4的分解和端粒的维持,从而挽救早衰细胞衰老并有助于其抗衰老特性。<span style="color: black;">咱们</span>的数据揭示了八珍汤<span style="color: black;">经过</span>延长端粒在抗衰老<span style="color: black;">关联</span><span style="color: black;">疾患</span>中的新的分子机制,这可能为八珍汤在端粒侵蚀<span style="color: black;">导致</span>的多种退行性<span style="color: black;">疾患</span>中的应用<span style="color: black;">供给</span>启示。</p>
<h2 style="color: black; text-align: left; margin-bottom: 10px;"><span style="color: black;">关键字 八珍汤 </span><span style="color: black;">转录组 </span><span style="color: black;">DNA 解旋酶 </span><span style="color: black;">端粒 </span><span style="color: black;">G-四链体</span></h2>
<h2 style="color: black; text-align: left; margin-bottom: 10px;"><span style="color: black;">2. 材料与<span style="color: black;">办法</span></span></h2>
<h3 style="color: black; text-align: left; margin-bottom: 10px;">2.1.八珍汤的制备</h3>
<p style="font-size: 16px; color: black; line-height: 40px; text-align: left; margin-bottom: 15px;">八珍汤的配方如下:人参C.A.Mey。30 克,熟地黄 (Gaertn.)DC. 30 g,芍药 pall.30 克、川芎 30 克、茯苓 (Schw.) 狼 30 克、当归 (Oliv.)Diels 30 g,Atractylodes macrocephala Koidz 30 g,Glycyrrhiza uralensis Fisch 30 g。这些草药由贵州中医药大学第二<span style="color: black;">附庸</span>医院开具(批号:20211020HU)。将草药浸泡在800 mL蒸馏水中,浸泡3 h,煮沸两次,得水提液。将提取物合并、过滤并浓缩至 0.6 g/mL。将<span style="color: black;">最后</span>溶液超声处理并离心(3000rmp,15min),收集上清液,用0.45μM膜过滤,等分试样,并储存在-20°C中。出于质量<span style="color: black;">掌控</span>的目的,<span style="color: black;">咱们</span>进行了HPLC以<span style="color: black;">得到</span>八珍汤的化学指纹图谱。参比药剂按八珍汤<span style="color: black;">成份</span>中常用药剂<span style="color: black;">选取</span>(<span style="color: black;"><span style="color: black;">弥补</span>图1</span>)。</p>
<p style="font-size: 16px; color: black; line-height: 40px; text-align: left; margin-bottom: 15px;"><img src="https://mmbiz.qpic.cn/mmbiz_png/ib3M4o3GrsDll1HUk6uN7pcPCVXZzjAtfcJs1kK2MUBdMRwA6dlQSFAYzQicOdaJoxViaHl83iaFlo92gIyju3e5LQ/640?wx_fmt=png&from=appmsg&tp=webp&wxfrom=5&wx_lazy=1&wx_co=1" style="width: 50%; margin-bottom: 20px;"></p>
<p style="font-size: 16px; color: black; line-height: 40px; text-align: left; margin-bottom: 15px;">为<span style="color: black;">保证</span>八珍汤在无毒剂量范围内<span style="color: black;">运用</span>,<span style="color: black;">咱们</span>应用CCK8测定八珍汤处理后的细胞活力。简言之,用连续浓度的八珍汤处理野生型MEFs24 h,并用CCK8检测试剂盒(Sangon Biotech)测定细胞活力。</p>
<h3 style="color: black; text-align: left; margin-bottom: 10px;">2.2. MEF细胞培养和处理</h3>
<p style="font-size: 16px; color: black; line-height: 40px; text-align: left; margin-bottom: 15px;"><span style="color: black;">所有小鼠实验<span style="color: black;">方法</span>均已<span style="color: black;">得到</span>贵州医科大学动物护理和<span style="color: black;">运用</span>委员会(2200057)的<span style="color: black;">准许</span>。WT(野生型)和G3DCO(</span><span style="color: black;">G3mTerc</span><span style="color: black;">−/−</span>Wrn<span style="color: black;">−/−</span><span style="color: black;">)在e13.5天内收获,并在含有10%胎牛血清(FBS)的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中培养,在37°C和5%CO</span><span style="color: black;">2</span><span style="color: black;">和 3% O</span><span style="color: black;">2</span><span style="color: black;">.在第 5 代之前<span style="color: black;">运用</span> MEF 进行实验,细胞以 1:2 或 1:3 的比例传代。</span></p>
<p style="font-size: 16px; color: black; line-height: 40px; text-align: left; margin-bottom: 15px;">用八珍汤(对照,低剂量(10 μg/mL)、高剂量(20 μg/mL))处理培养细胞48h。<span style="color: black;">针对</span> G4 结构稳定剂处理,用 5 μM 盐酸吡啶他丁 (PDS) (MCE) 处理细胞 24 小时。八珍汤和PDS联合处理,用八珍汤(对照,低剂量(10μg/mL),高剂量(20μg/mL))处理细胞24h,<span style="color: black;">而后</span>加入5μM PDS,继续处理24h。</p>
<h3 style="color: black; text-align: left; margin-bottom: 10px;">2.3.含药血清的制备</h3>
<p style="font-size: 16px; color: black; line-height: 40px; text-align: left; margin-bottom: 15px;">大鼠用药<span style="color: black;">方法</span>已<span style="color: black;">得到</span>贵州医科大学动物护理和<span style="color: black;">运用</span>委员会(2200058)的<span style="color: black;">准许</span>。6-8周龄雄性SD大鼠随机分为八珍汤组和对照组,每组8只。八珍汤组大鼠以12.6 g/<span style="color: black;">公斤</span>的剂量注胃注射八珍汤,对照组<span style="color: black;">每日</span>1次腹腔注射等体积生理盐水,连续7 d。第7天,末次给药后2 h,腹腔注射1%戊巴比妥钠,取血样制成含药血清。将同一组大鼠的血清混合,在56°C下灭活30分钟,用0.22μm膜过滤,并在4°C或-80°C下储存以备后用。</p>
<h3 style="color: black; text-align: left; margin-bottom: 10px;">2.4. RNA测序(RNA-seq)和转录组数据分析</h3>
<p style="font-size: 16px; color: black; line-height: 40px; text-align: left; margin-bottom: 15px;">WT细胞用八珍汤(对照,低剂量(10 μg/mL)、高剂量(100 μg/mL))处理24h。这些细胞被收获并送去进行RNA-seq的<span style="color: black;">商场</span>服务。<span style="color: black;">针对</span><span style="color: black;">每一个</span>样品,收集20G的RNA-seq数据进行进一步分析。数据由 EdgeR <span style="color: black;">运用</span>样本内归一化 (<span style="color: black;">https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html</span>) 进行归一化。</p>
<p style="font-size: 16px; color: black; line-height: 40px; text-align: left; margin-bottom: 15px;">进行单样本基因集富集分析(ssGSEA)(<span style="color: black;">Subramanian等人,2005</span>)以分析RNA-seq以<span style="color: black;">得到</span>信号通路的分数。来自分子特征数据库(<span style="color: black;">Liberzon等人,2011</span>)的C2和C5基因集被用作ssGSEA分析的通路数据库(<span style="color: black;">https://www.genepattern.org/</span>)。用Morpheus(<span style="color: black;">https://software.broadinstitute.org/morpheus</span>)绘制了顶部差异调控通路,以<span style="color: black;">得到</span>八珍汤调控的转录组谱。</p>
<h3 style="color: black; text-align: left; margin-bottom: 10px;">2.5. 蛋白质印迹</h3>
<p style="font-size: 16px; color: black; line-height: 40px; text-align: left; margin-bottom: 15px;">收获用/<span style="color: black;">不消</span>八珍汤处理的细胞,并在含有蛋白酶<span style="color: black;">控制</span>剂混合物(罗氏)的RIPA缓冲液中裂解。<span style="color: black;">经过</span>SDS-PAGE分离含有20 μg总蛋白的细胞裂解物,并将其转移到PVDF膜上。在室温下封闭膜在10%脱脂牛奶中的非特异性结合1小时,<span style="color: black;">而后</span>在4°C下与一抗孵育过夜,然后在室温下将辣根过氧化物酶标记的二抗孵育1小时,并用ECL观察。<span style="color: black;">运用</span>的<span style="color: black;">重点</span>抗是抗 Blm(1:1000,Invitrogen)、抗 Recql4(1:1000,Invitrogen)、抗 Pot1(1:1000,Invitrogen)、抗 Terf1(1:1000,Invitrogen)、抗 Mcm7(1:1000,Santa Cruz)、抗 Parp1(1:1000,Abcam)、抗 p53(1:5000,Proteintech)、抗 Rb(1:1000,BD pharmingen)、抗 p130(1:1000,Abcam)、抗 E2F1(1:1000,Novus)、抗 Cdc2(1:1000,CST)、抗 Cdk2(1:1000,CST)、抗肌动蛋白(1:1000,Santa Cruz)。</p>
<h3 style="color: black; text-align: left; margin-bottom: 10px;">2.6. qPCR检测</h3>
<p style="font-size: 16px; color: black; line-height: 40px; text-align: left; margin-bottom: 15px;"><span style="color: black;">经过</span>Trizol分离用/<span style="color: black;">不消</span>八珍汤处理的细胞的RNA,<span style="color: black;">而后</span>用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen)纯化。从RNA逆转录cDNA,并<span style="color: black;">按照</span>制造商的说明(Applied Biosystems)在ABI Prism 7300序列检测系统上<span style="color: black;">运用</span>SYBR-Green PCR预混液进行qPCR。<span style="color: black;">运用</span>的引物如下:</p>
<p style="font-size: 16px; color: black; line-height: 40px; text-align: left; margin-bottom: 15px;">Blm-F:AGCGACACTCAGCCAGAAAAC,</p>
<p style="font-size: 16px; color: black; line-height: 40px; text-align: left; margin-bottom: 15px;">Blm-R:GCCTCAGACACGTTCACATCTT;</p>
<p style="font-size: 16px; color: black; line-height: 40px; text-align: left; margin-bottom: 15px;">Recql4-F:CTCTACCGTGAGTACCGTAACCTAA,</p>
<p style="font-size: 16px; color: black; line-height: 40px; text-align: left; margin-bottom: 15px;">Recql4-R:AGTAGGCTCTGTTTTGGCATAGACT;</p>
<p style="font-size: 16px; color: black; line-height: 40px; text-align: left; margin-bottom: 15px;">Parp1-F:GGTCTTTAAGAGCGACGCTTAT, </p>
<p style="font-size: 16px; color: black; line-height: 40px; text-align: left; margin-bottom: 15px;">Parp1-R:TTCTGTGTCTTGACCATGCAC;</p>
<p style="font-size: 16px; color: black; line-height: 40px; text-align: left; margin-bottom: 15px;">Mcm7-F:AGTATGGGACCCAGTTGGTTC, </p>
<p style="font-size: 16px; color: black; line-height: 40px; text-align: left; margin-bottom: 15px;">Mcm7-R:GCATTCTCGCAAATTGAGTCG;</p>
<p style="font-size: 16px; color: black; line-height: 40px; text-align: left; margin-bottom: 15px;">Terf1-F:CAGCAGTCTACAGAAACTGAACC, </p>
<p style="font-size: 16px; color: black; line-height: 40px; text-align: left; margin-bottom: 15px;">Terf1-R:ACTGAAATCTGATGGAGCACG;</p>
<p style="font-size: 16px; color: black; line-height: 40px; text-align: left; margin-bottom: 15px;">GAPDH-F:GGTTGTCTCCTGCGACTTCA, </p>
<p style="font-size: 16px; color: black; line-height: 40px; text-align: left; margin-bottom: 15px;">GAPDH-R:TGGTCCAGGGTTTCTTACTCC.</p>
<h3 style="color: black; text-align: left; margin-bottom: 10px;">2.7. SA-β-Gal染色</h3>
<p style="font-size: 16px; color: black; line-height: 40px; text-align: left; margin-bottom: 15px;">如前所述进行SA-β-Gal染色(<span style="color: black;">Dimri等人,1995</span>)。简而言之,将培养的细胞固定并在37°C下对SA-β-半乳糖苷酶活性进行4小时染色。</p>
<h3 style="color: black; text-align: left; margin-bottom: 10px;">2.8. 流式细胞术检测</h3>
<p style="font-size: 16px; color: black; line-height: 40px; text-align: left; margin-bottom: 15px;"><span style="color: black;">针对</span>细胞周期分析,收获细胞并将其固定在冰冷的 70% 乙醇中过夜。固定后,用 1X PBS 基碘化丙啶溶液(50 μg/mL PI、100 μg/mL RNase A、0.1% 柠檬酸钠、0.1% Triton X-100)对细胞进行染色,并<span style="color: black;">经过</span>流式细胞术 (Agilent) 进行分析。</p>
<h3 style="color: black; text-align: left; margin-bottom: 10px;">2.9. 免疫荧光</h3>
<p style="font-size: 16px; color: black; line-height: 40px; text-align: left; margin-bottom: 15px;">将盖玻片上培养的细胞用2%多聚甲醛和2%蔗糖在1×PBS中固定10分钟,<span style="color: black;">而后</span>用1%NP-40透化。用 5% BSA/PBS 阻断非特异性结合后,将细胞与一抗<span style="color: black;">一块</span>孵育,<span style="color: black;">而后</span>与二抗在室温下在 1% BSA/PBS 中孵育 1 小时。<span style="color: black;">而后</span>用含有抗褪色封固剂(Solarbio)的DAPI封片载玻片。<span style="color: black;">运用</span>的一抗是抗γH2AX(1:1000,Abcam),抗DNA G-四链体(G4)抗体,克隆1H6(1:200,Merck),抗Blm(1:200,Invitrogen),抗Recql4(1:200,Invitrogen)。</p>
<h3 style="color: black; text-align: left; margin-bottom: 10px;">2.10. 端粒测定</h3>
<p style="font-size: 16px; color: black; line-height: 40px; text-align: left; margin-bottom: 15px;">免疫荧光联合荧光原位杂交 (IF-FISH):用八珍汤(对照,低剂量 (10 μg/mL)、高剂量 (20 μg/mL))处理在盖玻片上培养的细胞 48 小时。在 1 × PBS 中洗涤 3 次后,将细胞在 2% 蔗糖和 2% 多聚甲醛中固定 10 分钟,<span style="color: black;">而后</span>用 0.5% NP-40 透化。封闭溶液(2%明胶和0.5%BSA在1×PBS中)在室温下孵育1小时后,将一抗在4°C下施用过夜。<span style="color: black;">而后</span>将细胞与二抗在室温下孵育1小时。在 1 × PBST 中洗涤 3 次后,将细胞在室温下用 4% 多聚甲醛固定 10 分钟,并与端粒 PNA-FISH 探针 5′-FITC-green-(TTAGGG)-3′ (Panagene) 杂交。冲洗盖玻片并用含有抗褪色封固剂的DAPI复染(Solarbio)。IF-FISH的一抗:抗Recql4(1:200,Invitrogen),抗Blm(1:200,Invitrogen)。</p>
<p style="font-size: 16px; color: black; line-height: 40px; text-align: left; margin-bottom: 15px;"><span style="color: black;">端粒DNA qPCR测定:培养的细胞(1×10</span><span style="color: black;">5</span><span style="color: black;">细胞/孔在 6 孔板中)用八珍汤(对照,低剂量 (10 μg/mL)、高剂量 (20 μg/mL))处理 48 小时。<span style="color: black;">而后</span>将细胞传代 6 次 (1 × 10</span><span style="color: black;">5</span><span style="color: black;">细胞/孔在 6 孔板中),并继续进行八珍煎剂处理。收获第 7 代细胞,纯化基因组 DNA 用于基于 Syber green 的 qPCR。端粒DNA引物序列为:正向:5′-CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTGT-3′,反向:5′-GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCT-3。参考36B4 DNA引物序列为:正向:5′-ACTGGTCTAGGACCCGAGAAG-3′,反向:5′-TCAATGGTGCCTCTGGAGATT-3。</span></p>
<h2 style="color: black; text-align: left; margin-bottom: 10px;"><span style="color: black;">3. 结果</span></h2>
<h3 style="color: black; text-align: left; margin-bottom: 10px;">3.1. 应用八珍汤诱导的细胞转录组谱揭示了其抗衰老的系统功能</h3>
<p style="font-size: 16px; color: black; line-height: 40px; text-align: left; margin-bottom: 15px;">为了<span style="color: black;">得到</span>八珍汤调控分子通路的完整图像,<span style="color: black;">咱们</span>将RNA测序(RNA-seq)技术应用于有或<span style="color: black;">无</span>八珍汤处理的细胞。<span style="color: black;">因为</span>许多细胞系在永生化过程中携带多个基因突变,这可能会改变受影响的分子通路对八珍汤的反应,<span style="color: black;">咱们</span>利用原代培养的野生型小鼠胚胎成纤维细胞(WT MEF)<span style="color: black;">得到</span>了八珍汤诱导的细胞转录组。</p>
<p style="font-size: 16px; color: black; line-height: 40px; text-align: left; margin-bottom: 15px;">为<span style="color: black;">保证</span>八珍汤在无毒剂量范围内的应用,<span style="color: black;">咱们</span>进行了CCK8<span style="color: black;">实验</span>,以测试八珍汤处理系列剂量后的细胞活力。CCK8数据<span style="color: black;">显示</span>,八珍汤在1 μg/mL至100 μg/mL的剂量范围内未<span style="color: black;">表示</span>出细胞毒性,<span style="color: black;">乃至</span>在10 μg/mL时<span style="color: black;">表示</span>出细胞活力<span style="color: black;">增多</span>(<span style="color: black;"><span style="color: black;">弥补</span>图2</span>)。<span style="color: black;">因此呢</span>,<span style="color: black;">咱们</span><span style="color: black;">选取</span>低剂量为10 μg/mL,高剂量为100 μg/mL进行转录组谱分析。用低剂量(10 μg/mL,BZT-L)和高剂量(100 μg/mL,BZT-H)八珍汤处理后,将WT MEFs用于RNA-seq。对数据进行归一化,<span style="color: black;">经过</span>单样本基因集富集分析(ssGSEA)进行分析,得到八珍汤激活(上调)或<span style="color: black;">控制</span>(下调)的细胞通路。</p>
<p style="font-size: 16px; color: black; line-height: 40px; text-align: left; margin-bottom: 15px;">绘制了八珍汤调控前50条通路的热力图(<span style="color: black;">图1</span>)。在顶部上调通路中,<span style="color: black;">咱们</span><span style="color: black;">发掘</span>了干细胞通路,以及已知在干细胞调控中很重要的Wnt-B-Catenin通路。<span style="color: black;">咱们</span>还<span style="color: black;">发掘</span>烟酰胺代谢途径,已知对Sirtuins蛋白质功能和线粒体功能至关重要(<span style="color: black;">Houtkooper等人,2012</span>),被八珍汤激活(<span style="color: black;">图1</span>)。</p>
<p style="font-size: 16px; color: black; line-height: 40px; text-align: left; margin-bottom: 15px;"><img src="https://mmbiz.qpic.cn/mmbiz_png/ib3M4o3GrsDll1HUk6uN7pcPCVXZzjAtfO5W9t9icTbicibDjXfxX8Z0c1X7tlQTfVgY1UfLPtJMWarugJ27fzHutg/640?wx_fmt=png&from=appmsg&tp=webp&wxfrom=5&wx_lazy=1&wx_co=1" style="width: 50%; margin-bottom: 20px;"></p>
<p style="font-size: 16px; color: black; line-height: 40px; text-align: left; margin-bottom: 15px;">有趣的是,<span style="color: black;">咱们</span>的数据揭示了八珍汤上调与蛋白质糖基化<span style="color: black;">关联</span>的多种途径,蛋白质质量<span style="color: black;">掌控</span>和ER功能(<span style="color: black;">图1</span>),如糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定蛋白质合成、蛋白质糖基化、ER<span style="color: black;">关联</span>蛋白质降解途径、未折叠蛋白质的伴侣。这些途径<span style="color: black;">针对</span>维持蛋白质稳态、减少内质网应激和细胞凋亡至关重要。蛋白质稳态的下调已<span style="color: black;">作为</span>衰老的标志之一(<span style="color: black;">Lopez-Otin等人,2013</span>)。</p>
<p style="font-size: 16px; color: black; line-height: 40px; text-align: left; margin-bottom: 15px;">非常有趣的是,<span style="color: black;">咱们</span><span style="color: black;">发掘</span>八珍汤(<span style="color: black;">图1</span>)上调了神经元功能<span style="color: black;">关联</span>通路,<span style="color: black;">包含</span>突触囊泡内吞<span style="color: black;">功效</span>的过程,即感觉功能。已知这些途径的下调是神经元退行性<span style="color: black;">疾患</span>的症状。</p>
<p style="font-size: 16px; color: black; line-height: 40px; text-align: left; margin-bottom: 15px;">与八珍汤的原始功能之一(滋养造血系统)一致,<span style="color: black;">咱们</span><span style="color: black;">发掘</span>淋巴内皮通路中的VEGFR3信号被激活,血红蛋白降解通路下调。除此之外,血管紧张素转换和醛固酮合成(ACE)<span style="color: black;">控制</span>剂通路<span style="color: black;">亦</span>上调,这可能有助于<span style="color: black;">加强</span>心血管系统的健康(<span style="color: black;">图1</span>)。为了<span style="color: black;">弥补</span>这一<span style="color: black;">发掘</span>,<span style="color: black;">咱们</span>还<span style="color: black;">发掘</span>对 SARS-COV-2 的转录反应已下调(<span style="color: black;">图 1</span>)。<span style="color: black;">因为</span><span style="color: black;">发掘</span> ACE2 是 SARS-COV-2 的受体,这些数据<span style="color: black;">显示</span>八珍汤<span style="color: black;">能够</span><span style="color: black;">经过</span>影响 ACE 蛋白来阻断 SARS-COV-2。</p>
<p style="font-size: 16px; color: black; line-height: 40px; text-align: left; margin-bottom: 15px;">在这些下调通路中,<span style="color: black;">发掘</span>了多种炎症反应通路,<span style="color: black;">包含</span>TNFR2、IL4、IL2、IL3、TNFR1信号通路、促肾上腺皮质激素释放激素等(<span style="color: black;">图1</span>)。有趣的是,MAPK<span style="color: black;">关联</span>信号通路<span style="color: black;">亦</span>被下调,<span style="color: black;">包含</span>FCER1、TPO、甘丙肽受体、冠状病毒MAPK信号通路等(<span style="color: black;">图1</span>)。已知MAPK<span style="color: black;">关联</span>途径会诱导对应激的炎症反应,例如DNA<span style="color: black;">损害</span>、缺氧、氧化应激、病毒感染等。MAPK通路的激活是一种双刃剑事件。与此一致,氧化应激途径<span style="color: black;">亦</span>被下调(<span style="color: black;">图1</span>)。</p>
<p style="font-size: 16px; color: black; line-height: 40px; text-align: left; margin-bottom: 15px;">虽然<span style="color: black;">咱们</span>观察到p53调节的细胞周期阻滞和半胱天冬酶通路(图1)被低剂量的八珍汤下调,但<span style="color: black;">咱们</span><span style="color: black;">亦</span>观察到几种肿瘤<span style="color: black;">出现</span>通路的下调,如慢性粒细胞白血病、子宫内膜癌、胰腺癌通路等(<span style="color: black;">图1</span>)。</p>
<p style="font-size: 16px; color: black; line-height: 40px; text-align: left; margin-bottom: 15px;">令人惊讶的是,雷帕霉素(TOR)信号转导的靶标<span style="color: black;">亦</span>被下调(<span style="color: black;">图1</span>),其<span style="color: black;">控制</span><span style="color: black;">功效</span>广泛应用于抗衰老和抗肿瘤<span style="color: black;">药品</span>筛选。</p>
<p style="font-size: 16px; color: black; line-height: 40px; text-align: left; margin-bottom: 15px;">这些数据<span style="color: black;">一起</span>揭示了八珍汤的抗衰老功能<span style="color: black;">能够</span><span style="color: black;">经过</span>系统调控多种抗衰老途径来实现,<span style="color: black;">包含</span>干细胞调控、维持蛋白质稳态、促进心血管功能、改善神经元功能、抗炎、抗DNA<span style="color: black;">损害</span>诱导的应激等。</p>
<h3 style="color: black; text-align: left; margin-bottom: 10px;">3.2. 八珍汤的应用<span style="color: black;">经过</span>上调DNA解旋酶和端粒蛋白激活端粒维持途径</h3>
<p style="font-size: 16px; color: black; line-height: 40px; text-align: left; margin-bottom: 15px;">众所周知,端粒功能可能是干细胞功能、抗炎、抗DNA<span style="color: black;">损害</span>诱导应激等的维持机制,但<span style="color: black;">因为</span>端粒维持途径中基因丰度低,可能<span style="color: black;">没法</span><span style="color: black;">作为</span>转录组中最重要的途径。<span style="color: black;">因此呢</span>,<span style="color: black;">咱们</span>进一步绘制了端粒功能和DNA<span style="color: black;">损害</span>反应<span style="color: black;">关联</span>通路的热图,并试图剖析八珍汤在端粒维持中的功能。有趣的是,<span style="color: black;">咱们</span><span style="color: black;">发掘</span>端粒末端加工<span style="color: black;">关联</span>途径(如端粒加帽、端粒C链等)对端粒伸长和维持至关重要(<span style="color: black;">图2,A</span>)。端粒DNA修复通路<span style="color: black;">亦</span>上调(图2,A),<span style="color: black;">控制</span>端粒DNA<span style="color: black;">损害</span>诱导的细胞衰老(<span style="color: black;">图</span><span style="color: black;">2,A</span>)。</p>
<p style="font-size: 16px; color: black; line-height: 40px; text-align: left; margin-bottom: 15px;"><span style="color: black;">咱们</span>还<span style="color: black;">发掘</span>了八珍汤诱导的DNA解旋酶通路的上调(<span style="color: black;">图2,A</span>)。有趣的是,端粒酶通路并未<span style="color: black;">显著</span>受到八珍汤的调控(图2,A),<span style="color: black;">咱们</span><span style="color: black;">可疑</span>端粒的维持是<span style="color: black;">经过</span>端粒重组的激活(<span style="color: black;">图2,A</span>,<span style="color: black;">经过</span>重组上调端粒维持,下调端粒对DNA重组的<span style="color: black;">控制</span>)。与此一致,DNA<span style="color: black;">损害</span>修复途径<span style="color: black;">亦</span>上调(<span style="color: black;">图2,A</span>)。而八珍汤下调p53调节的细胞周期阻滞通路(<span style="color: black;">图1</span>)。<span style="color: black;">经过</span>GSEA分析进一步比较低剂量八珍汤治疗组与对照组的差异表达基因和通路。结果<span style="color: black;">显示</span>,八珍汤处理后DNA解旋酶活性通路<span style="color: black;">明显</span>上调(<span style="color: black;">图2,B</span>,标<span style="color: black;">叫作</span>p值=0.0068,FDR q值=0.0997)。将差异表达基因绘制在热图中,其中多个DNA复制<span style="color: black;">关联</span>DNA解旋酶、DNA<span style="color: black;">损害</span>修复和端粒<span style="color: black;">关联</span>蛋白上调,如DDX、Mcm、Ercc、Xrcc、Smarca、Blm、Fanc、PolQ等(<span style="color: black;">图2,C</span>)。总之,八珍汤<span style="color: black;">能够</span>促进DNA<span style="color: black;">损害</span>修复和端粒维持,减少DNA复制应激,从而促进细胞周期进程,防止细胞衰老。</p>
<p style="font-size: 16px; color: black; line-height: 40px; text-align: left; margin-bottom: 15px;">为了验证这些数据,<span style="color: black;">咱们</span>利用了来自Werner<span style="color: black;">综合症</span>小鼠的早衰MEF细胞(G3DKO细胞,其中DNA解旋酶Wrn和端粒酶Terc基因都被敲除),WT MEF细胞<span style="color: black;">做为</span>对照。<span style="color: black;">按照</span>CCK8数据(<span style="color: black;">弥补</span>图<span style="color: black;">2</span>)和转录组谱(<span style="color: black;">图1</span>),<span style="color: black;">咱们</span><span style="color: black;">认识</span>到低剂量(10 μg/mL)的八珍汤在维持细胞生长方面表现出更好的效果,<span style="color: black;">因此呢</span><span style="color: black;">咱们</span>用10 μg/mL和20 μg/mL八珍汤处理细胞进行进一步实验。Western blot数据<span style="color: black;">表示</span>,八珍汤处理上调了WT和G3DKO细胞中DNA解旋酶Blm、Mcm7的蛋白水平(<span style="color: black;">图2</span>D和E)。已知这些 DNA 解旋酶<span style="color: black;">能够</span>解开 DNA G4 结构,并促进 DNA 复制叉的<span style="color: black;">发展</span>,尤其是在端粒 DNA 复制过程中。端粒蛋白 Parp1 和 Terf1 <span style="color: black;">亦</span>上调,已知它们参与端粒包装和 C 链(滞后链)合成。<span style="color: black;">罢了</span>知参与端粒长度负调控的 Pot1 则下调(<span style="color: black;">图 2</span>D 和 E)。总之,八珍汤可能调节端粒DNA复制和端粒DNA<span style="color: black;">损害</span>反应,从而调节端粒延长。</p>
<p style="font-size: 16px; color: black; line-height: 40px; text-align: left; margin-bottom: 15px;"><span style="color: black;">同期</span>,<span style="color: black;">咱们</span>还观察到,八珍汤对抑癌基因p53蛋白水平<span style="color: black;">无</span><span style="color: black;">显著</span>影响,而p53下游效应因子p21在WT和G3DKO细胞中均上调(<span style="color: black;">图2</span>F和G)。有趣的是,另一个重要的抑癌因子Rb家族成员Rb和p130,众所周知的细胞周期<span style="color: black;">控制</span>剂,被八珍汤上调。而下游的Rb通路E2F1<span style="color: black;">亦</span>被上调,这应该是细胞周期<span style="color: black;">起步</span>子。这些数据<span style="color: black;">显示</span>,<span style="color: black;">经过</span>八珍汤(<span style="color: black;">图2</span>D-G)对细胞周期进程进行双面调节,<span style="color: black;">能够</span><span style="color: black;">保证</span>非致瘤性细胞周期进程。qPCR结果还<span style="color: black;">表示</span>,在WT和G3DKO细胞中,八珍汤处理后DNA解旋酶和端粒<span style="color: black;">关联</span>蛋白Recql4、Blm、Mcm7、Parp1、Terf1均上调(<span style="color: black;">图2</span>H和I),并进一步验证了Western blot揭示的这些蛋白的上调。</p>
<p style="font-size: 16px; color: black; line-height: 40px; text-align: left; margin-bottom: 15px;">综上所述,八珍汤可上调DNA解旋酶的表达,促进G4结构的解旋,从而促进DNA复制,尤其是端粒DNA复制。</p>
<p style="font-size: 16px; color: black; line-height: 40px; text-align: left; margin-bottom: 15px;"><img src="https://mmbiz.qpic.cn/mmbiz_png/ib3M4o3GrsDll1HUk6uN7pcPCVXZzjAtfAdJowBt6FUIPKS6oibnmZEj6xr8sheT9yRts6DxPCJfSvIUSd3BAy2g/640?wx_fmt=png&from=appmsg&tp=webp&wxfrom=5&wx_lazy=1&wx_co=1" style="width: 50%; margin-bottom: 20px;"></p>
<p style="font-size: 16px; color: black; line-height: 40px; text-align: left; margin-bottom: 15px;"><span style="color: black;">图 2</span><span style="color: black;">.八珍汤</span><span style="color: black;">经过</span><span style="color: black;">上调DNA解旋酶的表达,激活DNA解旋酶和端粒维持途径。一个。八珍汤上调DNA解旋酶和端粒维持通路。B.低剂量八珍汤处理 (BZT-L) 与对照组的 GSEA 分析。低剂量八珍汤处理后DNA解旋酶活性通路<span style="color: black;">明显</span>富集(上图)。富集图(下图)<span style="color: black;">显示</span>DNA解旋酶活性途径中<span style="color: black;">触及</span>的基因富集。C.基因的热图差异表达,并有助于B.D.解旋酶活性富集数据。八珍汤处理后,WT细胞或G3DKO细胞中DNA解旋酶Blm、Mcm7和端粒蛋白Parp1、Terf1的蛋白水平上调,端粒蛋白Pot1下调。E.D.F.的量化八珍汤处理后,WT细胞或G3DKO细胞中细胞周期<span style="color: black;">控制</span>剂p21、Rb、p130的蛋白水平上调,细胞周期<span style="color: black;">起步</span>子E2F1<span style="color: black;">亦</span>上调。G.F.H.的量化qPCR结果<span style="color: black;">表示</span>,八珍汤处理后WT细胞中DNA解旋酶Recql4、Blm、Mcm7和端粒蛋白Parp1、Terf1上调。I.qPCR结果<span style="color: black;">表示</span>,八珍汤处理后G3DKO细胞中DNA解旋酶Recql4、Blm、Mcm7和端粒蛋白Parp1、Terf1上调。</span></p>
<h3 style="color: black; text-align: left; margin-bottom: 10px;">3.3. 八珍汤促进DNA解旋酶募集到G4,减少G4结构的存在,并赋予细胞对DNA复制胁迫的抵抗力</h3>
<p style="font-size: 16px; color: black; line-height: 40px; text-align: left; margin-bottom: 15px;">鉴于用八珍汤处理的细胞中DNA解旋酶的<span style="color: black;">增多</span>,<span style="color: black;">咱们</span>进一步<span style="color: black;">科研</span>了这些DNA解旋酶<span style="color: black;">是不是</span>有助于解开G4结构,以及这可能<span style="color: black;">怎样</span>影响DNA复制应激。</p>
<p style="font-size: 16px; color: black; line-height: 40px; text-align: left; margin-bottom: 15px;"><span style="color: black;">咱们</span><span style="color: black;">首要</span><span style="color: black;">运用</span>抗G4抗体检测八珍汤处理前后G3DKO细胞中G4结构的量。<span style="color: black;">咱们</span><span style="color: black;">发掘</span>,八珍汤处理后G4结构信号<span style="color: black;">显著</span>减弱(<span style="color: black;">图3</span>A、B、G4),说明八珍汤处理后G4结构快速消退。<span style="color: black;">同期</span>,DNA解旋酶Recql4(图3,A,Recql4)和Blm(<span style="color: black;">图</span>3,B,Blm)的信号<span style="color: black;">加强</span>,处理后Recql4或Blm信号与G4结构的共定位<span style="color: black;">增多</span>。</p>
<p style="font-size: 16px; color: black; line-height: 40px; text-align: left; margin-bottom: 15px;">这些数据<span style="color: black;">一起</span><span style="color: black;">显示</span>,八珍汤<span style="color: black;">经过</span>促进 DNA 解旋酶 Recql4 和 Blm 向 G4 DNA 的募集来促进 G4 结构的解析,这可能会减少<span style="color: black;">因为</span> G4 结构的存在而<span style="color: black;">引起</span>的 DNA 复制应激诱导的 DNA <span style="color: black;">损害</span>。为了验证这一点,<span style="color: black;">咱们</span>在八珍汤处理前后用其标记物γ-H2AX检测了细胞DNA<span style="color: black;">损害</span>。数据<span style="color: black;">表示</span>,G3DKO细胞中的DNA<span style="color: black;">损害</span><span style="color: black;">显著</span>(<span style="color: black;">图3,C</span>,对照),这可能是<span style="color: black;">因为</span>Wrn和端粒酶敲除诱导的背景DNA复制应激<span style="color: black;">导致</span>。八珍汤的应用大大降低了γ-H2AX信号,<span style="color: black;">显示</span>早衰细胞复制应激诱导的DNA<span style="color: black;">损害</span>减弱(<span style="color: black;">图</span>3,C,BZT)。</p>
<p style="font-size: 16px; color: black; line-height: 40px; text-align: left; margin-bottom: 15px;">为了进一步证实这些数据,<span style="color: black;">咱们</span>应用吡啶抑素(PDS,一种 G4 稳定剂)来稳定 G4 结构并诱导 DNA 复制应激(DNA <span style="color: black;">损害</span>)。<span style="color: black;">咱们</span><span style="color: black;">首要</span><span style="color: black;">评定</span>了DNA解旋酶蛋白的表达,<span style="color: black;">发掘</span>PDS处理<span style="color: black;">能够</span>下调G3DKO细胞中DNA解旋酶Blm、Recql4、Mcm7、端粒蛋白Parp1和细胞周期蛋白Cdc2、Cdk2,而八珍汤<span style="color: black;">能够</span>挽救这些蛋白的表达(<span style="color: black;">图3</span>D和E)。这些数据<span style="color: black;">显示</span>,八珍汤<span style="color: black;">能够</span>逆转PDS治疗的影响。<span style="color: black;">运用</span>G4抗体,<span style="color: black;">咱们</span>证实,与对照细胞相比,PDS处理稳定并<span style="color: black;">增多</span>了G4结构的数量,而即使在PDS处理存在的<span style="color: black;">状况</span>下,八珍汤<span style="color: black;">亦</span><span style="color: black;">能够</span><span style="color: black;">显著</span>减弱G4信号(<span style="color: black;">图</span>3,F,G4)。<span style="color: black;">咱们</span>再次观察到,尽管PDS处理,八珍汤仍促进了Recql4和Blm蛋白的表达及其与G4结构的共定位(<span style="color: black;">图</span>3,F,Recql4,Blm)。<span style="color: black;">而后</span>,<span style="color: black;">咱们</span>检测了PDS在有/<span style="color: black;">无</span>八珍汤诱导的DNA<span style="color: black;">损害</span>。用PDS处理的细胞<span style="color: black;">表示</span>出<span style="color: black;">增多</span>的γ-H2AX信号,<span style="color: black;">显示</span>PDS诱导DNA<span style="color: black;">损害</span>(<span style="color: black;">图</span>3,G,PDS)。而八珍汤的应用<span style="color: black;">显著</span>减弱了PDS诱导的γ-H2AX信号,<span style="color: black;">显示</span>八珍汤<span style="color: black;">能够</span>逆转PDS诱导的G4稳定和DNA复制应激的影响(<span style="color: black;">图</span>3,G,PDS+BZT)。</p>
<p style="font-size: 16px; color: black; line-height: 40px; text-align: left; margin-bottom: 15px;">以上数据<span style="color: black;">显示</span>,八珍汤<span style="color: black;">经过</span>减少DNA复制应激在细胞周期进程中的<span style="color: black;">功效</span>。<span style="color: black;">而后</span>,<span style="color: black;">咱们</span>应用流式细胞术分析八珍汤处理后的细胞周期进程。细胞周期分析<span style="color: black;">显示</span>,八珍汤可轻度促进细胞周期进程,降低G1期细胞百分比,<span style="color: black;">增多</span>S期和G2期细胞百分比(<span style="color: black;">图3,H</span>)。PDS处理还诱导了G2细胞的<span style="color: black;">增多</span>,这可能是<span style="color: black;">因为</span>DNA复制应激<span style="color: black;">导致</span>。有趣的是,八珍汤加PDS的应用再次降低了G1期细胞的百分比,并略微<span style="color: black;">增多</span>了S期和G2期的百分比(<span style="color: black;">图3,H</span>)。这些数据<span style="color: black;">显示</span>,八珍汤对细胞周期进程有轻度调节<span style="color: black;">功效</span>。</p>
<p style="font-size: 16px; color: black; line-height: 40px; text-align: left; margin-bottom: 15px;">总之,这些数据<span style="color: black;">显示</span>,八珍汤<span style="color: black;">能够</span>促进G4结构的分解,并赋予细胞对PDS处理<span style="color: black;">导致</span>的DNA复制应激的抵抗力。这些功能<span style="color: black;">一起</span><span style="color: black;">加强</span>了细胞周期的质量<span style="color: black;">掌控</span>。</p>
<p style="font-size: 16px; color: black; line-height: 40px; text-align: left; margin-bottom: 15px;"><img src="https://mmbiz.qpic.cn/mmbiz_png/ib3M4o3GrsDll1HUk6uN7pcPCVXZzjAtfoO2A6LTtnicPIdpu6vs7rhnkIclptWwAVBVU30LVCxSjgAf8hRh0blA/640?wx_fmt=png&from=appmsg&tp=webp&wxfrom=5&wx_lazy=1&wx_co=1" style="width: 50%; margin-bottom: 20px;"></p>
<p style="font-size: 16px; color: black; line-height: 40px; text-align: left; margin-bottom: 15px;"><span style="color: black;"><span style="color: black;">图 3</span><span style="color: black;">.在G3DKO细胞中,八珍汤上调DNA解旋酶,促进G4结构的分解,减少PDS诱导的DNA<span style="color: black;">损害</span>。一个。八珍汤减弱了G4结构的信号,而Recql4信号<span style="color: black;">上升</span>,观察到Recql4和G4信号的共定位性较多。B.八珍汤减弱了G4结构的信号,而Blm信号<span style="color: black;">上升</span>,<span style="color: black;">能够</span>观察到<span style="color: black;">更加多</span>的Blm和G4信号共定位。C.八珍汤应用降低了G3DKO细胞中DNA<span style="color: black;">损害</span>标志物γ-H2AX的信号。D.在G3DKO细胞中,PDS处理下调DNA解旋酶Blm,Recql4,Mcm7,端粒蛋白Parp1和细胞周期蛋白Cdc2,Cdk2,而八珍汤挽救了这些蛋白的表达。E. D.F.的量化PDS处理稳定了G4信号,下调了DNA解旋酶Recql4和Blm,而PDS联合八珍汤挽救了Recql4和Blm的表达,降低了G4信号。G.PDS处理的细胞γ-H2AX信号<span style="color: black;">上升</span>,而八珍汤的应用<span style="color: black;">显著</span>减弱了PDS诱导的γ-H2AX信号。H.G3DKO细胞流式细胞术分析<span style="color: black;">显示</span>,八珍汤<span style="color: black;">经过</span>降低G1期细胞的百分比,<span style="color: black;">增多</span>S期和G2期的百分比,<span style="color: black;">能够</span>轻度调节细胞周期进程。</span></span></p>
<h3 style="color: black; text-align: left; margin-bottom: 10px;">3.4. 八珍汤促进早衰样细胞端粒伸长,逆转细胞衰老</h3>
<p style="font-size: 16px; color: black; line-height: 40px; text-align: left; margin-bottom: 15px;">以上数据<span style="color: black;">显示</span>,八珍汤可促进G4结构的分离,而G4结构是端粒DNA中丰富的结构,<span style="color: black;">因此呢</span>八珍汤可能有助于端粒DNA的复制和伸长。为了验证这一点,<span style="color: black;">咱们</span><span style="color: black;">首要</span>进行了免疫荧光和荧光原位杂交(IF-FISH)来检测DNA解旋酶向端粒DNA的募集。IF-FISH数据<span style="color: black;">表示</span>,八珍汤处理后DNA解旋酶Recql4和Blm表达上调(<span style="color: black;">图4</span>A和B,Recql4,Blm)。有趣的是,八珍汤处理后端粒DNA信号<span style="color: black;">明显</span><span style="color: black;">增多</span>(<span style="color: black;">图4</span>A和B,端粒),DNA解旋酶Recql4与端粒DNA的共定位<span style="color: black;">亦</span><span style="color: black;">增多</span>(图4,A,端粒和Recql4,白色箭头),与Blm相同(<span style="color: black;">图4,B</span>,端粒和Blm,白色箭头)。</p>
<p style="font-size: 16px; color: black; line-height: 40px; text-align: left; margin-bottom: 15px;"><span style="color: black;">咱们</span>进一步进行了端粒DNA qPCR,比较了八珍汤处理前后端粒DNA的相对长度。结果<span style="color: black;">显示</span>,八珍汤处理后端粒DNA信号<span style="color: black;">明显</span><span style="color: black;">增多</span>(p < 0.01)(<span style="color: black;">图4,C</span>)。这些数据<span style="color: black;">显示</span>,八珍汤上调DNA解旋酶,促进DNA解旋酶募集到端粒DNA,促进端粒伸长。</p>
<p style="font-size: 16px; color: black; line-height: 40px; text-align: left; margin-bottom: 15px;">为了测试这些早衰细胞中端粒的伸长<span style="color: black;">是不是</span><span style="color: black;">能够</span>挽救它们的衰老,<span style="color: black;">咱们</span>对有/<span style="color: black;">无</span>八珍汤处理的G3DKO细胞进行了SA-β-Gal染色。<span style="color: black;">咱们</span><span style="color: black;">发掘</span>,八珍汤<span style="color: black;">能够</span>降低SA-β-Gal染色信号,<span style="color: black;">显示</span>G3DKO衰老的挽救(<span style="color: black;">图4</span>D和E)。</p>
<p style="font-size: 16px; color: black; line-height: 40px; text-align: left; margin-bottom: 15px;"><img src="data:image/svg+xml,%3C%3Fxml version=1.0 encoding=UTF-8%3F%3E%3Csvg width=1px height=1px viewBox=0 0 1 1 version=1.1 xmlns=http://www.w3.org/2000/svg xmlns:xlink=http://www.w3.org/1999/xlink%3E%3Ctitle%3E%3C/title%3E%3Cg stroke=none stroke-width=1 fill=none fill-rule=evenodd fill-opacity=0%3E%3Cg transform=translate(-249.000000, -126.000000) fill=%23FFFFFF%3E%3Crect x=249 y=126 width=1 height=1%3E%3C/rect%3E%3C/g%3E%3C/g%3E%3C/svg%3E" style="width: 50%; margin-bottom: 20px;"></p>
<p style="font-size: 16px; color: black; line-height: 40px; text-align: left; margin-bottom: 15px;"><span style="color: black;">图 4</span><span style="color: black;">.八珍汤处理拉长了G3DKO细胞的端粒,挽救了早衰样细胞衰老。A. IF-FISH<span style="color: black;">表示</span>,八珍汤处理后DNA解旋酶Recql4上调(Recql4),端粒DNA信号<span style="color: black;">明显</span><span style="color: black;">增多</span>,Recql4与端粒DNA的共定位<span style="color: black;">增多</span>(端粒和Recql4,白色箭头指向共定位点)。B. IF-FISH<span style="color: black;">表示</span>,八珍汤处理后,解旋酶Blm(Blm)上调,端粒DNA信号<span style="color: black;">明显</span><span style="color: black;">增多</span>,Blm与端粒DNA的共定位<span style="color: black;">增多</span>(端粒&Blm,白色箭头指向共定位点)。C. qPCR数据<span style="color: black;">表示</span>,八珍汤处理后端粒相对长度<span style="color: black;">明显</span><span style="color: black;">增多</span>(p < 0.01)。D.八珍汤处理后G3DKO细胞的SA-β-Gal信号<span style="color: black;">显著</span>减弱,提示早衰样细胞衰老的挽救。E.D的量化。</span></p>
<h2 style="color: black; text-align: left; margin-bottom: 10px;"><span style="color: black;">4. 讨论</span></h2>
<p style="font-size: 16px; color: black; line-height: 40px; text-align: left; margin-bottom: 15px;">八珍汤等经典中药方剂已有效应用于治疗与衰老<span style="color: black;">关联</span>的退行性<span style="color: black;">疾患</span>或维持长寿功能。然而,<span style="color: black;">因为</span>这种<span style="color: black;">繁杂</span>的中药体系的药理<span style="color: black;">科研</span>受限,很难<span style="color: black;">评估</span>药理<span style="color: black;">功效</span>和随访临床<span style="color: black;">结果</span>。</p>
<p style="font-size: 16px; color: black; line-height: 40px; text-align: left; margin-bottom: 15px;">系统生物学驱动的组学策略的应用可能有助于理解中药的药理机制,并可能<span style="color: black;">引起</span><span style="color: black;">发掘</span>新的治疗方向(<span style="color: black;">Guo et al., 2020</span>;<span style="color: black;">Wu 等人,2019</span> 年)。基于网络药理学的<span style="color: black;">办法</span>已被用于<span style="color: black;">认识</span>丹参(丹参的干燥根茎)对贫血的<span style="color: black;">功效</span>和机制,并揭示了Jak-Stat信号是其功能的关键途径(<span style="color: black;">He等人,2022</span>)。多组学技术已应用于剖析真武不气汤的机制,并揭示了其在调节多种炎症<span style="color: black;">关联</span>通路中的<span style="color: black;">功效</span>,如PI3K-akt、MAPK信号通路和NF-κB信号通路(<span style="color: black;">Zhai et al., 2022</span>)。已<span style="color: black;">发掘</span>大柴胡汤剂可调节肠道微生物群和谷胱甘肽代谢,如多组学所揭示的那样(<span style="color: black;">Huang 等人,2023</span>年)。系统生物学驱动的组学<span style="color: black;">办法</span>在剖析<span style="color: black;">繁杂</span>中药汤剂的分子机制方面看起来<span style="color: black;">特别有</span><span style="color: black;">期盼</span>。</p>
<p style="font-size: 16px; color: black; line-height: 40px; text-align: left; margin-bottom: 15px;">在<span style="color: black;">这儿</span>,<span style="color: black;">咱们</span>应用系统的药理学<span style="color: black;">办法</span>对八珍汤进行<span style="color: black;">科研</span>。<span style="color: black;">经过</span>RNA测序和ssGSEA分析,<span style="color: black;">得到</span>了野生型遗传背景下八珍汤调控的转录组谱。<span style="color: black;">这般</span>,<span style="color: black;">咱们</span><span style="color: black;">能够</span>避免在细胞系<span style="color: black;">创立</span>过程中<span style="color: black;">出现</span>的基因突变<span style="color: black;">导致</span>的信号通路改变。野生型细胞调控八珍汤的转录组图谱揭示了八珍汤对干细胞调控、蛋白稳态、心血管功能、神经元功能、抗炎、抗DNA<span style="color: black;">损害</span>诱导应激等多种抗衰老途径的系统调控<span style="color: black;">功效</span>。该转录组图谱和<span style="color: black;">仔细</span>的信号通路对<span style="color: black;">将来</span><span style="color: black;">科研</span>八珍汤在<span style="color: black;">各样</span>器官退行性<span style="color: black;">疾患</span>中的干扰功能非常有用。<span style="color: black;">咱们</span>认为,在野生型遗传背景下应用的转录组模式将更适合反映八珍汤处理的真实反应,<span style="color: black;">由于</span>细胞中的任何突变都可能改变通路和细胞反应。以野生型细胞反应为参考,对其他在<span style="color: black;">区别</span>细胞中工作、<span style="color: black;">拥有</span><span style="color: black;">区别</span>基因突变的人会更有<span style="color: black;">帮忙</span>。</p>
<p style="font-size: 16px; color: black; line-height: 40px; text-align: left; margin-bottom: 15px;"><span style="color: black;">针对</span><span style="color: black;">以上</span>可能的抗衰老特性,端粒维持可能是维持干细胞功能、防止DNA<span style="color: black;">损害</span>、改善器官功能、抗炎等的<span style="color: black;">平常</span>分子<span style="color: black;">基本</span>。与此一致,<span style="color: black;">咱们</span>对转录组的进一步分析<span style="color: black;">显示</span>,八珍汤处理<span style="color: black;">能够</span>上调DNA解旋酶活性和端粒延长的途径。众所周知,DNA 复制的顺利<span style="color: black;">发展</span><span style="color: black;">针对</span>端粒维持和细胞周期进程至关重要(<span style="color: black;">Brenner 和 Nandakumar,2022</span>)。然而,染色体脆弱位点<span style="color: black;">包括</span>特殊的 DNA 二级结构,例如端粒 G-四链体 (G4) 结构。这些结构阻碍了复制叉的<span style="color: black;">发展</span>,并<span style="color: black;">引起</span>复制压力(<span style="color: black;">Lezaja 和 Altmeyer,2020</span>年)。DNA解旋酶<span style="color: black;">起步</span>复制起点,<span style="color: black;">经过</span>解开G4结构形成DNA复制叉,<span style="color: black;">保准</span>DNA复制的顺利进行。解旋酶功能缺陷诱导DNA复制应激,激活DNA<span style="color: black;">损害</span>反应途径,并<span style="color: black;">引起</span>衰老或肿瘤<span style="color: black;">出现</span>(<span style="color: black;">Bochman和Schwacha,2009</span>;<span style="color: black;">Zeman 和 Cimprich,2014</span>年)。DNA解旋酶基因的突变<span style="color: black;">引起</span>早衰<span style="color: black;">综合症</span>,如Werner<span style="color: black;">综合症</span>(Wrn基因突变)(Epstein et al., 1966)、Bloom<span style="color: black;">综合症</span>(Blm gene突变)(German et al., 1965)、Rothmund-Thomson<span style="color: black;">综合症</span>(Recql4基因突变)(<span style="color: black;">Kitao et al.,</span> <span style="color: black;">1999</span>)等。<span style="color: black;">因此呢</span>,DNA解旋酶活性和端粒延长途径的上调可能是八珍汤抗衰老特性的最重要机制之一。</p>
<p style="font-size: 16px; color: black; line-height: 40px; text-align: left; margin-bottom: 15px;">为进一步<span style="color: black;">认识</span>八珍汤对DNA解旋酶和端粒的调控<span style="color: black;">功效</span>,以Werner<span style="color: black;">综合症</span>小鼠早衰样细胞为<span style="color: black;">科研</span>对象,验证了八珍汤对DNA解旋酶Blm、Recql4、Mcm7和端粒调节蛋白Parp1、Terf1的调控<span style="color: black;">功效</span>。端粒<span style="color: black;">守护</span>蛋白Pot1在八珍汤水提液直接处理时下调,而在含<span style="color: black;">药品</span>血清处理时上调。<span style="color: black;">科研</span><span style="color: black;">显示</span>,解旋酶 Blm 对解开 G4 结构<span style="color: black;">拥有</span>很强的活性,并且<span style="color: black;">针对</span>端粒 DNA 前导链的合成很重要(<span style="color: black;">Drosopoulos 等人,2015</span> 年)。<span style="color: black;">已然</span><span style="color: black;">发掘</span>解旋酶 Fancm、Brca1 和 Blm 调节 DNA 末端加工和同源重组(<span style="color: black;">Pan 等人,2017</span>年)。还<span style="color: black;">发掘</span> Blm 蛋白<span style="color: black;">能够</span>促进 Holiday 连接的解析,并且 Recql4 蛋白<span style="color: black;">能够</span><span style="color: black;">帮忙</span> DNA 双链断裂修复和端粒 DNA 维持(<span style="color: black;">Ghosh 等人,2012</span> 年)。<span style="color: black;">科研</span><span style="color: black;">显示</span>,Terf1 <span style="color: black;">能够</span>与 Blm 合作改善端粒滞后链 DNA 合成,从而淬灭端粒复制过程中<span style="color: black;">出现</span>的 DNA <span style="color: black;">损害</span>诱导的 ATR 信号传导(<span style="color: black;">Bianco 等人,2019</span>年)。Pot1已被证明与端粒单链DNA结合并<span style="color: black;">守护</span>端粒免受DNA<span style="color: black;">损害</span>反应,并且很可能<span style="color: black;">控制</span>端粒的伸长(<span style="color: black;">de Lange,2018</span>;<span style="color: black;">Denchi 和 de Lange,2007</span> 年)。<span style="color: black;">同期</span>还<span style="color: black;">发掘</span> Pot1 <span style="color: black;">能够</span>破坏端粒 G4 并在体外促进端粒酶扩展(<span style="color: black;">Zaug 等人,2005</span>)。<span style="color: black;">因此呢</span>,<span style="color: black;">咱们</span>推测八珍汤对这些DNA解旋酶和端粒蛋白的上调会影响G4 DNA和端粒伸长。<span style="color: black;">经过</span>应用G4抗体和G4稳定剂PDS,验证了八珍汤<span style="color: black;">能够</span>促进G4结构的分解,赋予细胞对复制应激诱导的DNA<span style="color: black;">损害</span>的抵抗力,促进细胞周期的质量<span style="color: black;">掌控</span>,促进端粒伸长。</p>
<p style="font-size: 16px; color: black; line-height: 40px; text-align: left; margin-bottom: 15px;"><span style="color: black;">咱们</span>还揭示了八珍汤<span style="color: black;">能够</span>挽救Werner<span style="color: black;">综合症</span>小鼠模型中早衰样细胞的细胞衰老。<span style="color: black;">咱们</span>的数据<span style="color: black;">显示</span>,八珍汤有可能治疗遗传性早衰<span style="color: black;">综合症</span>,尤其是<span style="color: black;">哪些</span>有端粒功能<span style="color: black;">阻碍</span>的人。事实上,<span style="color: black;">有些</span><span style="color: black;">大夫</span><span style="color: black;">已然</span><span style="color: black;">运用</span>八珍汤来治疗再生<span style="color: black;">阻碍</span>性贫血(<span style="color: black;">Fang,2012</span>;<span style="color: black;">Zhu, 2015</span>)。遗传性再生<span style="color: black;">阻碍</span>性贫血是<span style="color: black;">因为</span>端粒酶<span style="color: black;">反常</span>(例如,先天性角化不良<span style="color: black;">综合症</span>)或 DNA 解旋酶(例如,Fanconi 贫血)功能(<span style="color: black;">Bhandari 等人,2022</span> 年;<span style="color: black;">Grill 和 Nandakumar,2021</span> 年)。而散发性再生<span style="color: black;">阻碍</span>性贫血的病因<span style="color: black;">重点</span>是造血干细胞的DNA<span style="color: black;">损害</span>。进一步<span style="color: black;">科研</span>Werner<span style="color: black;">综合症</span>小鼠模型,<span style="color: black;">评估</span>八珍汤对器官衰老及<span style="color: black;">关联</span><span style="color: black;">疾患</span>的<span style="color: black;">功效</span>。</p>
<p style="font-size: 16px; color: black; line-height: 40px; text-align: left; margin-bottom: 15px;">令人惊讶的是,从转录组图谱中,<span style="color: black;">咱们</span>还揭示了八珍汤可用于预防和治疗 COVID-19。有趣的是,已知 COVID-19 会损害消化功能和心血管功能,这是八镇汤的两个靶点(四骏子汤<span style="color: black;">守护</span>消化功能,四雾汤<span style="color: black;">守护</span>心血管功能)。抗炎特征<span style="color: black;">亦</span>可能有助于 COVID-19 治疗。</p>
<p style="font-size: 16px; color: black; line-height: 40px; text-align: left; margin-bottom: 15px;">总之,<span style="color: black;">咱们</span>的数据<span style="color: black;">供给</span>了八珍汤调节的可能途径的完整图像。转录组分析揭示的特征通路比单个基因变异更准确、更稳定,可<span style="color: black;">做为</span>中医系统的生物标志物。随着临床<span style="color: black;">科研</span>的深入,这些中药方剂关键信号通路可在<span style="color: black;">必定</span>程度上应用于临床药理效果的定量<span style="color: black;">评估</span>,并阐明经典长寿方剂在衰老<span style="color: black;">关联</span><span style="color: black;">疾患</span>防治中的<span style="color: black;">功效</span>和分子机制,以<span style="color: black;">指点</span>中医药临床<span style="color: black;">精细</span>治疗。</p>
<p style="font-size: 16px; color: black; line-height: 40px; text-align: left; margin-bottom: 15px;">DNA 复制应激和端粒侵蚀是衰老<span style="color: black;">关联</span><span style="color: black;">疾患</span>的基本问题(<span style="color: black;">Rossiello 等人,2022</span> 年;<span style="color: black;">Zeman 和 Cimprich,2014</span>年)。探索<span style="color: black;">拥有</span>端粒维持活性的天然产物是抗衰老<span style="color: black;">行业</span>最活跃的<span style="color: black;">专题</span>之一。环黄芪酚以其在端粒酶激活和端粒伸长中的活性而闻名(<span style="color: black;">Liu等人,2017</span>)。<span style="color: black;">因此呢</span>,<span style="color: black;">发掘</span>八珍汤应用<span style="color: black;">能够</span><span style="color: black;">作为</span>处理DNA复制应激和端粒侵蚀的一种非常安全有效的策略,从而有利于衰老<span style="color: black;">关联</span><span style="color: black;">疾患</span>的治疗,这是非常令人兴奋的。</p>
<h2 style="color: black; text-align: left; margin-bottom: 10px;"><span style="color: black;">5. 结论</span></h2>
<p style="font-size: 16px; color: black; line-height: 40px; text-align: left; margin-bottom: 15px;">转录组图谱<span style="color: black;">表示</span>,八珍汤可能系统调控多种抗衰老途径,<span style="color: black;">包含</span>干细胞调控、蛋白稳态、心血管功能、神经元功能、抗炎、抗DNA<span style="color: black;">损害</span>诱导的应激、DNA解旋酶活性和端粒延长。<span style="color: black;">咱们</span>的数据揭示了一种识别中药药理学特征通路的新策略,有助于中医临床<span style="color: black;">精细</span>医疗。实验数据证实,八珍汤可上调多种DNA解旋酶和端粒调节蛋白,促进G-四链体(G4)结构的解析,促进DNA复制和端粒伸长,赋予细胞对复制应激诱导的DNA<span style="color: black;">损害</span>的抵抗力,挽救早衰细胞衰老。这些数据为<span style="color: black;">咱们</span><span style="color: black;">供给</span>了<span style="color: black;">运用</span>八珍汤治疗DNA复制应激和端粒侵蚀<span style="color: black;">关联</span>退行性<span style="color: black;">疾患</span>的<span style="color: black;">潜能</span>。</p>
你的见解真是独到,让我受益良多。 交流如星光璀璨,点亮思想夜空。
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